解决方案|解决方案|液相色谱法测定水产品中孔雀石绿

前言

孔雀石绿（ MG ）为三苯甲烷类工业染料 , 在水产养殖上可以有效的预防与治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小虫病，并常用于鱼苗的消毒。但一些水产品贩运商为保持水产品新鲜度普遍用 MG 消毒车厢和活鱼池；酒店为了延长鱼的存活时间也在鱼池中投放 MG 进行消毒。使用 MG 消毒后的鱼即使死亡后颜色也较为鲜亮，消费者很难从外表进行辨认。MG 在水生生物体中的主要代谢产物为隐色孔雀石绿（ LMG ）。MG 具有毒性强、高残留和致畸、致癌、致突变等副作用。LMG 由于不溶于水，其残留毒性比 MG 更强，保留时间更长。 所以，目前世界上诸如美国、日本、加拿大和欧盟等许多国家已将 MG 列为水产养殖禁用药物，我国也于 2002 年 5 月将其列入 “ 食品动物禁用的兽药及其化合物清单 ”。虽然 MG 已被列为水产养殖禁用药物，但因为其价格低廉，同时目前在水霉病防治上尚无其它有效药品，因此仍有一些水产养殖户在普遍使用。

本文根据GB/T 19857-2005《水产品中孔雀石绿和结晶紫残留量的测定》和水产行业标准 SC/T 3021-2004《水产品中孔雀石绿残留量的测定 液相色谱法》，利用我公司高效液相色谱LC-5520紫外检测器测定水产品中孔雀石绿，供相关人员参考。

LC-5520液相色谱仪

PART ONE

实验部分

仪器设备与试剂

LC-5520 液相色谱仪（紫外检测器）；

AS-405 自动进样器；

DM-101 在线脱气机；

乙睛 色谱纯，

乙酸铵 色谱纯 ， 

孔雀石绿（ MG ） sigma 试剂； 

隐色孔雀石绿（ LMG ） sigma 试剂。 

实验条件

色谱柱：氰基柱，4.6mm × 250mm ，5 μ m ； 

流动相：乙睛 -0.125mol/L 乙酸铵（pH4.5） = （47+53）； 

流速：1.0 mL/min；

检测波长：618 nm；

柱温：35 ℃；

进样量：20 μL。

PART TWO

实验结果

标准谱图

吸取MG和LMG 标准混合溶液（ 5.0 μ g/mL ）注入色谱仪，在上述色谱条件下，绘制色谱图。见图 1 。 

图1  5.0 μ g/mL 孔雀石绿和无色孔雀石绿标准混合溶液色谱图

流动相的选择 

MG和LMG的 HPLC 法分离，无论是 C 18 柱还是氰基柱，多采用乙睛和乙酸铵作流动相的反相体系。其中乙酸铵浓度对MG和LMG的分离有很大影响。对于梯度洗脱方式多采用 50mmol/L 乙酸铵溶液，而等梯度洗脱方式乙酸铵溶液浓度较大,为0.125mol/L。

流动相溶剂比例的影响

在上述色谱条件下，用1.0 μ g/mL MG和LMG标准混合溶液在不同比例（V/V）的乙睛—0.125mol/L 乙酸铵溶液中观察分离效果，结果表明，在乙睛-乙酸铵溶液（pH4.5）=47+53 时分离效果好，灵敏度最高，所以选择该溶剂比为流动相为。见表 1 。 

最低检测浓度 

在上述色谱条件下，以 3S/N 的响应信号为最低检测浓度，LMG 的最低检测浓度为 0.02 μ g/mL ，MG 的最低检测浓度为 0.05 μ g/mL 。均能满足试验要求。见图 2 。

图2  LMG 和 MG 最低检测浓度

线性范围试验 

上述色谱条件下，LMG和MG 线性关系均良好。LMG和MG线性范围为2 μ g/mL-160.0 μ g/mL，r＞0.999。其中LMG和MG在0.2 μ g/mL-10.0 μ g/mL范围的校正曲线见图 3；1.0 μ g/mL-160.0 μ g/mL范围的校正曲线见图4。

图3  LMG（a）和MG（b）校正曲线1（0.2 μ g/mL-10.0 μ g/mL）

图4  LMG（c）和MG（d）校正曲线 2（1.0 μ g/mL-160.0 μ g/mL）

精密度试验

在上述色谱条件下，分别用1.0 μ g/mL、5.0 μ g/mL 和10.0 μ g/mL LMG/MG 混合标准溶液进行平行性测定。保留时间相对标准偏差（ RSD ）一般小于0.4%，峰面积相对标准偏差小于5%。见表2。 

PART THREE

实验总结

液相色谱法测定水产品中孔雀石绿的方法中，SC/T3021-2004 采用C18柱，等梯度洗脱方式，但需要较大流速（2ml/min）；而GB/T19857-2005法采用C18柱，梯度洗脱方式。文献有采用氰基柱分离的梯度洗脱方式。我们在研究这些分析方法的基础上，采用氰基柱分离、流速为 1.0mL/min 的等度洗脱方式，具有保留时间短、分离效果好、分析速度快、节省试剂；最低检测浓度LMG为0.02 μ g/mL，MG为0.05 μ g/mL。精密度高；特别是线性范围达0.1 μ g/mL-160.0 μ g/mL，远远大于 SC/T3021-2004线性范围（MG 0.01 μ g/m L-0.4 μ g/mL；LMG 0.02 μ g/mL-0.40 μ g/mL）。而且，等梯度洗脱方式又扩大了液相色谱的应用范围。

LC-5520 高效液相色谱仪测定水产品中LMG和MG，该方法操作简便、分离效果好、分析速度快、节省试剂、精密度高、灵敏准确、线性范围宽等优点，适用于水产品中 LMG 和 MG 含量检测。

关于我们

北京东西分析仪器有限公司，拥有三十多年的分析仪器研发、制造、服务的历史，系国家高新技术企业、北京市高新技术企业、北京市“专精特新”小巨人企业、北京市“专精特新”中小企业和分析仪器制造行业国际化企业。拥有计量器具资质、医疗器械资质和安标资质等多项资质证书。多次获得BCEIA金奖和行业最具影响力奖。在行业内率先通过ISO9001国际质量体系认证，ISO14001环境管理体系认证。多个产品取得欧盟CE认证，系中华预防医学会卫检专用委员会产品信得过单位。

“完美分析，辉映东西”。公司以科研技术实力为后盾，以质量管理为保证，以完善的售后服务为支撑，为用户提供高品质的分析仪器产品。