解决方案|高效液相色谱法测定奶粉中的三聚氰胺

三聚氰胺是一种重要的化工原料，是作为塑料、涂料等行业的改性剂。普通的全氮测定法测奶粉等食品中的蛋白质含量时不能排除伪蛋白氮的干扰，一些违法企业为了提高产品中的蛋白质含量将三聚氰胺作为伪蛋白质非法添加到食品、饲料等产品中。实验研究结果显示，虽然三聚氰胺本身毒性轻微，但它一旦与氰尿酸结合后会造成肾中毒，严重影响人类健康。

三聚氰胺的检测方法通常有液相色谱法、气相色谱法、液相色谱-质谱/质谱法、气相色谱-质谱法等。本文根据国家标准GB/T 22388-2008 《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》，建立了利用高效液相色谱LC-5520测定奶粉中三聚氰胺的方法，供相关人员参考。

LC-5520液相色谱仪

实验原理

将试样用三氯乙酸溶液—乙腈提取，经阳离子交换固相萃取柱净化后，用高效液相色谱测定，外标法定量测定三聚氰胺的含量。

仪器设备与试剂

LC-5520 液相色谱仪（紫外检测器）；

阳离子交换固相萃取柱：(SCX，Agilent Technologies);

甲醇（色谱纯）；

乙腈；

氨水：含量为25%～28%；

三氯乙酸；

柠檬酸；

辛烷磺酸钠；

三聚氰胺标准品。

实验条件

色谱柱：C₁₈柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；

流动相：离子对试剂缓冲液-乙腈（90+10，体积比）；

流  速：1.0 mL/min； 

检测波长：240 nm；

柱温：：室温；

进样量：20 μL。

样品处理

提取 

称取2 g（精确至0.01 g）试样于50mL具塞塑料离心管中，加入15 mL三氯乙酸溶液和5mL乙腈，超声提取10 min，再振荡提取10 min后，以不低于4000 r·min^-1离心10min。上清液经三氯乙酸溶液润湿的滤纸过滤后，用三氯乙酸溶液定容至25 mL，移取5 mL滤液，加入5 mL水混匀后做待净化液。

净化 

将待净化液转移至固相萃取柱中。依次用3 mL水和3 mL甲醇洗涤，抽至近干后，用6 mL氨化甲醇溶液洗脱。整个固相萃取过程流速不超过1mL·min^-1。洗脱液于50 ℃下用氮气吹干，残留物（相当于0.4 g样品）用1 mL流动相定容，涡旋混合1 min，过微孔滤膜后，供HPLC测定。

标准谱图

图1 三聚氰胺标准样品线性色谱图

标准曲线的绘制

待仪器稳定后，将标准溶液按浓度由低到高进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线如图2。线性方程，相关系数如表1所示。

图2 三聚氰胺标准曲线

样品分析

空白试验

除不称取样品外，均按上述测定条件和步骤进行。空白样本的色谱图见图3。

图3 空白样本色谱图

空白实验样本中未检出三聚氰胺。

试样测定

根据《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》规定，HPLC的定量限为2 mg·kg^-1。某品牌奶粉在重复性条件下，获得三聚氰胺两次独立测定结果如下，见表2、图4、图5。

图4 样品第一次独立测定色谱图

图5 样品第二次独立测定色谱图

由图2可知，三聚氰胺标准样品的保留时间在32min左右，样品谱图中在32min左右未出三聚氰胺的色谱峰，因此可判断样品中未含三聚氰胺。

回收率

在样品中分别添加2 mg·kg^-1、6 mg·kg^-1和 10 mg·kg^-1三聚氰胺标准品，做回收率实验。

在添加浓度2 mg·kg^-1-10 mg·kg^-1浓度范围内，回收率在85.45%～92.77%之间。