2022-04-14 10:33:51, 徕卡显微系统 徕卡显微系统(上海)贸易有限公司
荧光成像远超您的想象!
FLIM-标准
FLIM的黄金标准是“时间相关单光子计数”TCSPC,它可以与共聚焦显微镜和多光子显微镜兼容。用脉冲激光照射样本,测量发射光子到达的时间。为获得典型寿命值,这种测量要在同一样本位置重复几次。需要测量几百个事件才能达到大约10%的准确度。然后将数据按时间分组放入直方图中。然后对该直方图中随时间出现的衰变进行数学拟合,并直接提供所需的荧光寿命(图01a-c)。
图01a:测量被脉冲激光激发(蓝色箭头)后发射光子(红色箭头)的到达时间tᵢ。此处绘制了5个测量值。
图01b:到达时间的直方图,包括上述示例中五个事件的集合。大多数计数#时间都很短。直方图用指数衰减(红色)来拟合。
图01c:拟合显示,例如,两个单衰变(蓝色和绿色曲线),衰变时间t₁和t₂,振幅为A₁和A₂。求和将再次获得红色衰变曲线。
这个过程是最精确的,并可以重复,但需要一定时间。测量后,系统在大约100纳秒的死区时间内准备好进行下一次发射。要录入400个事件,测量一个像素的时间达40微秒。一张512x512的图像大约需要12秒,这无法适应快速变化和运动的生命系统。
目前的解决方案需要一定的技术灵活性、复杂的手动数据处理和精密的评价程序。
新标准
徕卡显微系统推出了一款新型FLIM显微镜:STELLARIS FALCON(FAst Lifetime CONtrast)荧光寿命成像系统可以解决以上所有问题。
本系统基于混合探测器(HyD),是理想的寿命成像传感器,具有极短的死区时间。激光脉冲序列和发射光子脉冲都以高采样率即刻实现数字化,将测得的距离直接输入数据池。这些到达时间用于输出“快速-FLIM”图像。
新方法可以使用大多数激光脉冲,并应用一个过滤器来限制只有一个光子发射的脉冲事件。在第一个光子到达后不久,随即到达的光子不可避免的会被忽略,可以通过智能数学方法进行校正。基于以上种种因素,图像记录速度提高了10倍。
所有FALCON FLIM成像均集成在共聚焦显微镜中。记录FLIM就像激活一个额外的通道。用于3D、时间和光谱系列的多维采集模式可立即用于FLIM成像。例如题图:具有经典组织学染色的小鼠胚胎。使用NAVIGATOR软件,拍摄了722个视野,每个视野为512x512像素的图片。原始图像有1.9亿像素。用四个指数对寿命进行拟合,并以颜色进行编码。
应用实例
在功能成像领域,我们希望监测小分子、离子或电势的动态变化。这通常是用荧光探针完成的。其中多数显示出强度和寿命的变化。也可以用荧光蛋白装饰蛋白质,并在活细胞中表达这些构建体。该技术利用FRET跟踪活细胞中的分子相互作用。最为现代化的工具是蛋白质或肽,它们与所需的分析物(例如Ca2+)结合,并装饰有一对进行FRET的荧光蛋白。结合分析物后,肽将发生构象变化,FRET将出现或消失。这些探针被称为FRET-生物传感器。生物传感器的一种是利用cAMP结合蛋白Epac。
图02:用游离态的cAMP刺激培养细胞,并用Epac FRET-生物传感器进行监测。在红色圆圈区域分析信号(平均到达时间tₐ)。随时间变化的图示见底部。由K.Jalink,B.van den Broek,NKI Amsterdam(NL)提供。
STELLARIS FALCON的新技术速度够快,可以在活细胞中使用化学传感器和FRET生物传感器进行荧光寿命成像。
无标记应用是分析活体材料中的内源性荧光。例如:癌细胞抑制细胞呼吸,倾向于无氧糖酵解(瓦博格效应),这会导致积累更高浓度的荧光NADH。即使不进行切片,多光子显微镜也能在皮肤组织中进行深度成像。同样,寿命对比度要可靠得多,因为深层的显微镜会受到吸收和阴影效应的影响,从而使强度信号失真。
传统意义上,不同的荧光染料以其不同的颜色来区分。如果激发和发射相同,仍然可以通过寿命进行区分。发射强度和应该寿命可以独立记录。因此,可分辨荧光染料组合的数量是发射光谱和拟合寿命的乘积。
图03:lt-染料分离的原理证据(6个信号)。用480 nm激发云杉叶的新鲜切片,在两个通道(顶部和底部行)中进行记录,每个通道可分开显示三个寿命(从左到右)。由Leica Microsystems的I.Steinmetz提供支持。
总结
徕卡显微系统的STELLARIS FALCON(FAst Lifetime CONtrast)共聚焦和多光子显微镜汇集了所有这些新技术和新概念,该FLIM技术,适用于多个应用领域。相较于传统的TSCPS方法(时间相关单光子计数),图像采集速度快了10倍,是迄今为止寿命成像的黄金标准。从而可以使用寿命对比来监测活体样本的运动学和动力学情况。
其直接实现和自动化使研究人员不再需要耗时于硬件调整和数据评估。3D堆叠、延时序列、镶嵌扫描和激发或发射波长扫描等复杂的数据采集模式与FLIM技术无缝结合。
04-19
全域感知,“育”见环博 | 谱育科技再赴上海环博会之约04-19 点击关注→
融合创新,质领未来 | 青源峰达“THz+ & IC+”双生态亮相2024第十七届中国科学仪器发展年会04-18 SHINE
近期热招职位 | 春暖花开之际,来和我们做同事吧04-18
来真的,揭秘药物销量榜“药王”诞生04-18
圆满收官丨慕尼黑俄罗斯分析生化展览会落下帷幕!奥谱天成创新成果闪耀全场04-18
BET系列新品即将发布!国仪量子邀您参加CIBF202404-18 CIQTEK
顺磁小课堂47期 | 操作EPR谱仪不能携带手机、银行卡、硬盘等磁性物体?04-18 CIQTEK
培训通知 | 国仪量子2024年第二期SEM线下应用培训班04-18 CIQTEK
【实验室动态】QD中国样机实验室引进M91快速霍尔测量仪,极低迁移率材料测量速度提升100倍!04-18 Dr. Shen
病原微生物测序方案,您想了解的都在这里04-18
探索生命之光,让每一次检测都清晰可见!04-18 aladiin
土壤/沉积物中的有机碳、无机碳及元素碳检测方案 | 德国元素04-18 德国元素
Moku时间间隔与频率分析仪发布!表征和控制系统应用的全面解决方案。04-18 圈内人都会关注
杂质溯源及清除率研究04-18 ACD/Labs
国际展会 | 鉴知技术探索俄罗斯实验室仪器展04-18 鉴知技术
拒绝网络谣言,守护清朗园区04-18 国产精密仪器厂家
【知识&好礼】 ATAC-seq(染色质开放性测序)速览04-17
【预告】让你的核酸检测精准高效04-17
橙达仪器受邀参加中国化学会第十八届全国有机合成化学学术研讨会04-17 Orienda