【技术攻略】从原理到实验设置，带你全面了解熔解曲线

那么熔解曲线是如何产生的呢？随着PCR的进行，双链产物的不断增加，嵌入到双链中的荧光分子也不断增多，荧光信号逐渐增强。在扩增结束后，体系内的双链产物最多，荧光信号强度达到一个最高值。之后我们设置一段由65℃逐渐升温到95℃的程序，随着温度逐渐升高，DNA双链逐渐解链为单链，嵌入到双链中的荧光染料分子也会逐渐脱落下来，荧光信号强度逐渐下降。在某段温度时，双链迅速而大量地解链，荧光信号强度骤然下降，在这段温度中，一半的双链解链的温度我们称为熔解温度（即Tm值）。最终，DNA双链完全解链为单链，荧光值下降为一个本底水平。这一整体过程中的荧光信号随温度变化的曲线就是熔解曲线，称为原始图谱。该图谱做负导数换算后得到熔解曲线的导数图谱，导数图谱会出现熔解峰，熔解峰对应的温度就是Tm值。

不同的产物按照其GC含量，片段大小，盐离子浓度的不同，其对应的Tm值也是不同的。所以，不同的产物在导数图谱中表现为不同位置的熔解峰。通过观察熔解曲线的形态，就可以判断PCR反应是否只扩增出了单一产物，是否有非特异结果出现。

 1. 引物设计不合理，存在非特异扩增或引物二聚体

﹥提高模板的加入量

﹥降低引物的加入量

﹥稍微提升退火温度

﹥重新设计合适的定量引物得到特异扩增产物

 2. 体系存在杂质或污染

﹥提取RNA之后进行RNA纯度和完整性鉴定，避免使用不纯的模板

﹥操作过程在超净台中进行，避免引入环境污染

﹥注意试剂的取用和保存，避免交叉污染

 3. 试剂抗逆性较差 

﹥优化反应条件和反应体系

﹥选用高效的荧光定量试剂消除非特异性扩增

荧光定量主题月活动火热进行中

众多优惠及好礼不容错过！

活动详情请咨询当地销售人员