恒光讲堂｜近红外二区（NIR-II）监测药物性肝损伤——NO响应性比率荧光纳米探针的应用

2022-02-18 02:51:24, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：目前，药物性肝损伤（DILI）的诊断主要依靠排除法。此法耗时且不可靠，可能给后续治疗带来困难。因此，迫切需要开发新的方法来精确诊断DILI。一氧化氮（NO）被认为是DILI早期统一、直接和重要的生物标记物，目前，NO检测的主要技术是化学发光成和第一近红外（NIR-I，650～900纳米）窗口的荧光成像。然而，化学发光的半衰期太短，无法保证持续观察。NIR-I荧光成像存在强光散射、组织吸收，限制了深层组织成像。关于分析物的定量检测，比率荧光探针由于于其内置的自校准功能，允许更高的SBR和更准确可靠的特定目标检测。目前用于NO活体成像的比率NIR-II荧光探针还尚未开发。

作者合理设计开发了一种NO响应性比率荧光纳米探针DCNP@MPS@IR NO，该探针用于第二个近红外（NIR-II）窗口荧光成像可以定量检测NO和监测DILI（图1）。在NO存在的情况下，IR NO转化为IR RA，DCNP@MPS@IR NO在808nm激发下（F1050Em，808Ex）在1050nm处呈现“开启”荧光信号，在980nm激发下（F1550Em，980Ex）在1550nm处呈现“始终开启”荧光信号，这导致了出现比率荧光信号F 1050Em，808Ex / F 1550Em，980Ex的“开启”。随后作者将DCNP@MPS@IR NO应用于肝损伤模型，体内结果显示DCNP@MPS@IR可用于量化扑热息痛（APAP）诱导的肝损伤中的NO，监测DILI，并通过NIR-II比率荧光成像筛选APAP的解毒剂。由此作者设想纳米探针DCNP@MPS@IR NO在不久的将来可能成为一种非常有用的生物技术工具，用于药物性肝损伤的可视化和早期诊断，并在临床上揭示药物肝毒性的机制。

首先基于分子内光诱导电子转移（PET）依赖的荧光开关机制，作者设计了一种小分子有机染料IR NO来响应NO。如图1a所示，作为电子受体的菁荧光团与给电子的邻苯二胺单元共轭以构建IR NO。由于IR NO中的分子内PET过程，菁荧光团的荧光被猝灭。在NO存在下，IR NO的邻苯二胺单元可转化为弱给电子能力的苯并三唑，从而阻断PET过程并恢复菁荧光团的荧光。最后，获得了发射波长为1050nm（808nm激发）的NIR-II荧光IR-RA。然后，通过将NO敏感部分IR NO和内标物下转换纳米粒子（DCNP，在980nm激发时发射1550nm）整合到载体介孔SiO2（MPS）中，合理设计了NO响应核～壳结构NIR-II比率荧光纳米探针DCNP@MPS@IR NO（图1b）。DCNP作为核心首先被封装到无定形二氧化硅中以形成核-壳结构DCNP@SiO2.DCNP@Si2, 然后蚀刻和装载IR NO以提供DCNP@MPS@IR NO。DCNP@MPS@IR NO体内检测NO使DILI可视化的机制如图1c所示。过量的药物摄入可导致肝组织损伤，加速L-精氨酸转化为NO，并显著增加肝细胞内源性NO水平。在静脉注射到患有DILI的小鼠体内后，纳米探针DCNP@MPS@IR NO由于肝脏的清除功能，将在肝脏中富集。在被内化到肝细胞并被NO触发时，DCNP@MPS@由于IR NO转化为IR RA，IR NO在808 nm激发下（记录为F 1050Em，808Ex）将在1050 nm处呈现“开启”NIR-II荧光。相反，DCNP@MPS@IR NO在980 nm激发下（记录为F 1550Em，980Ex ）来自DCNP的1550 nm处的荧光信号的保持不变。因此，DCNP@MPS@IR-NO荧光强度比（ F 1050Em，808Ex / F 1550Em，980Ex）为NO响应后升高。因此，使用该比率NIR-II荧光纳米探针，可以在体内精确定量和可视化NO浓度，从而进一步实现DILI的体内比率荧光成像。

图1：（a）示意图显示了基于分子内PET依赖的“开启”荧光机制的IRNO对NO的响应机制。（b） NO响应纳米探针DCNP@MPS@IR NO的制备步骤示意图（c）NO响应纳米探针DCNP@MPS@IRNO用于体内监测药物过量引起的肝损伤的图示。过量的药物（此处，对乙酰氨基酚（APAP）被用作模型药物）会导致肝损伤，伴随NO的过度表达。存在NO时，DCNP@MPS@IRNO中的IR NO将转换为IRRA，并伴有“开启” F 1550Em，808Ex信号和“始终开启” F 1550Em，980Ex信号。利用F1050 Em、808 Ex和F1550 Em、980 Ex的比例，可以定量检测小鼠DILI中的NO，从而在体内监测DILI。

NO响应NIR-II比率荧光纳米探针DCNP@MPS@IR NO的制备。通过使用亲核取代反应将菁染料IR 1061与DABT简单偶联获得IR NO（图2a）. DABT、IR NO和IR 1061的紫外-可见-近红外吸收光谱表明，DABT在400-1000 nm范围内没有明显的吸收峰，IR 1061在900 nm处有一个宽的吸收峰，在实验中无法观察到IR NO的光谱， IR NO在812 nm处有一个微弱的近红外吸收峰（图2b）。当在808nm激发时，IR NO和IR 1061在1050nm左右有一个荧光（FL）发射峰，而DABT发射一个可忽略的NIR-II荧光信号（图2c）。特别是5μM IR-NO中的5μM IR 1061的荧光强度仅为84.9%，这是由于前者的细胞内PET效应。上述紫外-可见-NIR光谱和FL表征进一步证实了具有猝灭荧光的IR NO的成功合成。

图2：（a）IR NO的合成路线（b，c）紫外−可见−NIR吸收光谱（d−f） TEM图像，DCNP（d）DCNP@SiO2（e） DCNP@MPS@IR NO（f）。（g） Zeta电位值DCNP@MPS和DCNP@MPS@IRNO （h）紫外−可见−NIR吸收光谱5μM I R N O 在 DCM中，20ug/ml的DCNP@MPS和DCNP@MPS@IR NO在水中（i） 200μg/ml的DCNP, DCNP@MPS和DCNP@MPS@IR NO在水中的荧光光谱。

随后，作者研究了IR-NO对NO的光学性质。将PBS中的IR NO（10μM）与10μM NO在37°C下孵育15分钟。然后，测定治疗前后IR-NO的UV-可见光-近红外吸收光谱和荧光光谱。如图3a所示，在存在NO的情况下，457 nm处IR NO的最大吸收峰分裂为428和511 nm处的两个峰，同时在700 nm-1000纳米范围内899纳米处吸收增加。同时，IR-NO在1050nm处的荧光强度是未经治疗的9.2倍（图3b）。这些结果表明，当IR-NO的邻苯二胺结构与NO反应形成一个供电子能力减弱的三唑环时，IR-NA中的PET效应消失，NIR-II荧光信号立即恢复。同时，作者研究了DCNP@MPS@IRNO对NO的比率响应。0.2毫克/毫升PBS中的DCNP@MPS@IR NO与不同浓度的NO孵育（0-100uM)在37°C下放置15分钟，并在808/980 nm激光激发下记录这些样品的荧光光谱。观察到，随着NO浓度的增加，899 nm处的吸收逐渐增加（图3c）。这归因于纳米探针中的IR NO在NO存在下转化为IR RA，这与图3a中的结果一致。正如预期的那样，DCNP@MPS@IR NO的F1050 Em、808 EX信号随着NO浓度的增加明显增加（图3d）。相比之下，F1550 Em、980 Ex信号在不同浓度的NO下显示出较小的变化，这是由于该纳米探针的DCNP具有极好的稳定性（图3e）。关联DCNP@MPS@IRNO的FL强度比（F1050 Em，808 Ex/F1550 Em，980 Ex）随着NO浓度的增加，我们发现F1050 Em，808 Ex/F1550 Em，980 Ex强度与NO浓度（0-100μM）具有线性关系（Y=0.006220X +0.2044，R2=0.9933）（图3f）。DCNP@MPS@IR NO对NO计算的检测限（LOD）为0.61μM。上述结果充分验证了应用荧光比率纳米探针DCNP@MPS@IRNO定量检测NO的可行性。

图3：（a，b）紫外线-可见光-近红外吸收光谱（a）和荧光光谱（b）10μM IR NO在PBS中用10μM N O 在 37°C处理15 min前后。（c～e）紫外线-可见-近红外吸收光谱（c）和荧光光谱（d，e）0.2mg/ml PBS中DCNP@MPS@IR NO用不同浓度NO处理的（0～100uM），37℃下15分钟。（f）DCNP@MPS@IR-NO的 FL信号比（F1050 Em，808 Ex/F1550 Em，980 Ex）随NO浓度的增加而增加的线性关系。（g，h）F1050 Em，808 Ex信号强度（g）F1550 Em，980 Ex信号强度（h）0.2毫克/毫升PBS中的DCNP@MPS@IR NO在37°C下，不使用任何物质（空白）或各种分析物（100μM）处理15分钟（i）从面板（g，h）中获取NIR-II比率荧光强度。

众所周知，APAP是一种比较常见的解热镇痛药。最近的一项研究表明，过量服用APAP可导致以肝小叶中央纤维化为特征的肝损伤。作者选择APAP诱导的小鼠肝损伤模型来研究DCNP@MPS@IR NO用于检测体内NO和监测DILI的能力。小鼠首先腹腔注射过量的APAP（300 mg/ml）建立肝损伤模型。六小时后，DCNP@MPS@IR NO（2mg/ml, 尾静脉注射200μL（记录为APAP组）。在808/980nm激光激发下，在1050/1550nm处记录每只小鼠的NIR-II荧光时间过程图像。如图4a所示，小鼠的肝脏区域可以在1050和1550 nm处清晰地映射NIR-II FL信号。值得注意的是，DCNP@MPS@IR-NO中属于IR NO的1050 nm的FL信号在注射后90min内显示出随时间变化的增加模式，在90分钟时达到顶峰，与5分钟时相比，信号强度增强了2.5倍（图4a，b）。这些结果表明DCNP@MPS@IR-NO对APAP诱导的肝损伤小鼠肝脏中的NO有有效的反应，在90min内纳米探针在肝脏中的转化率高于其清除率，随后，两个进程保持平衡。相比之下，在1550 nm处，来源于NO-不敏感DCNP的肝脏区域的荧光信号在5分钟内迅速达到最大值，并且在整个150分钟的监测期间表现出可忽略的变化，这表明纳米探针在5分钟内在肝脏中迅速积累，在其富集率和消除率之间保持平衡，并在随后的观察期内表现出良好的稳定性（图4a，c）。基于1050nm和1150nm处的荧光信号，获得了f1050em、808ex/f1550em和980ex的时程近红外-Ⅱ比值信号。正如预期的那样，这一比率在前90分钟内显示出上升趋势，在随后的60分钟内几乎没有波动，这与F1050Em，808 Ex信号的趋势完全一致（图4a，d）。特别是，90分钟（0.5±0.02）的比值为5分钟（0.21±0.001）时的2.4倍，清楚地指示“开启”F1050Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex信号。实际上，使用90分钟时的比率信号值和图3f中的线性关系，计算出肝脏中的NO浓度为47.5± 3.8uM, 总的来说，这些结果很好地证明DCNP@MPS@IR NO基于NO的F1050 Em、808 Ex/F1550Em、980 Ex信号的触发“开启”，有可能用于定量检测NO和可视化DILI。

图4：（a） APAP组小鼠的时间历程NIR-II FL图像和相应的比率图像。（b，c）1050nm处相应的量化平均荧光强度（b）1550nm（c）记录时间点的肝脏区域。（d）记录时间点肝脏区域的相应量化平均比率信号；1050和1550 nm分别代表F1050 Em、808 Ex和F1550 Em、980 Ex。比率代表F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex。

为了进一步确认1050nm处的“开启”NIR-II荧光信号和“开启”比率信号确实是由APAP诱导的肝损伤期间产生的NO引起的，作者随后在没有DILI的小鼠上进行NIR-II荧光成像。给小鼠注射药物DCNP@MPS@IR NO（2毫克/毫升-尾静脉注射PBS（300μL）（记录为PBS组）6小时后，通过尾静脉注射200μL）。然后在808/980 nm激光激发下，在1050/1550 nm处收集每只小鼠的时间历程NIR-II荧光图像。结果发现，在整个150分钟的观察期内，距离肝脏区域1050 nm处的FL信号没有显示任何增加，并且远弱于APAP组（图4a、b和5a、b）。特别是，90分钟时的FL强度为在同一时间点APAP组的1/2.8。这些结果表明，DCNP@MPS@IR-NO由于肝脏中的低NO浓度，IR NO没有转化为IR RA。同时，1550 nm处的荧光在监测期间保持明亮，没有明显变化，这与APAP组一致（图5c）。此外，F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex的比率信号每个时间点保持在约0.2的低值（图5d）。值得注意的是，使用90分钟时的比值（0.21±0.0004）和图3f中的线性关系，PBS组肝脏的NO浓度计算为0.96 ± 0. 06μM，显著低于APAP组（47.5±3.8μM）（P<0.01）。这一结果进一步表明APAP组肝脏NO水平异常。上述结果表明，纳米探针的F1050 Em、808 Ex信号和F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex比例信号在体内的“开启”主要归因于肝脏中NO的过度表达。

图5。（a） PBS组小鼠的时间历程NIR-II FL图像和相应的比率图像。（b，c）1050nm处相应的量化平均荧光强度（b）1550nm（c）记录时间点的肝脏区域。（d）记录时间点肝脏区域的相应量化平均比率信号；1050和1550 nm分别代表F1050 Em、808 Ex和F1550 Em、980 Ex。比率代表F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex。

在临床上，NAC是APAP中毒的常用解毒剂，可用于减轻APAP引起的肝损伤，副作用小。作者研究了纳米探针DCNP@MPS@IR-NO是否可用于评价NAC对APAP所致肝损伤的修复作用。按照APAP组的方法建立APAP诱导的肝损伤模型。然后注射APAP5小时后将小鼠腹腔注射NAC（300 mg /ml）以减轻肝损伤，1小时后，DCNP@MPS@IR NO（2mg/ml, 尾静脉注射200μL（记录为APAP-NAC组）。然后在808/980 nm激光激发下，在1050/1550 nm处获得每只小鼠的时间历程NIR-II荧光图像。如图6a，b所示，肝脏区域1050 nm处的FL信号在90分钟时缓慢增加至顶峰，信号强度仅为5分钟时的1.04倍。F1050-Em，808-Ex信号的“开启”程度远低于APAP组，这是由于NAC治疗后NO含量减少所致。与APAP组和PBS组一样，APAP-NAC组小鼠的肝脏区域在整个观察期间在1550 nm处发出明亮稳定的荧光（图6a，c）。因此，APAP NAC组的比率FL信号的“开启”程度远低于APAP组，90分钟时F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex的最大信号强度仅为APAP组中在同一时间点的1/2.4。上述结果充分证明NAC能有效减轻APAP诱导的肝损伤，DCNP@MPS@IR NO在筛选DILI解毒剂方面大有可为。

图6：（a） APAP-NAC组小鼠的时间历程NIR-II FL图像和相应的比率图像。（b，c）相应的量化平均荧光强度1050nm（b）和1550nm（c）记录时间点的肝脏区域。（d）记录时间点肝脏区域的相应量化平均比率信号；1050和1550 nm分别代表F1050 Em、808 Ex和F1550 Em、980 Ex。比率代表F1050 Em、808 Ex/F1550 Em、980 Ex 。

参考文献

Bai Feicheng,et al."A NO-Responsive Ratiometric Fluorescent Nanoprobe for MonitoringDrug-Induced Liver Injury in the Second Near-InfraredWindow.." Analytical chemistry .(2021):doi:10.1021/ACS.ANALCHEM.1C02238.

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