各种修饰型寡核酸的LC/MS分析

      反义核酸等为代表的核酸药物，不仅可以用于先天性基因疾病和代谢异常的治疗，还具有作为抗癌药物及疫苗使用的广泛应用前景。到目前为止，被批准的核酸药物主要是20mer左右的碱基配对低聚核酸（DNA,RNA），其中大部分都进行了化学修饰。用S（硫原子）取代O（氧原子）的磷酸化寡核酸（见图1）比未修饰的寡核酸在体内更不易被分解，稳定性更高。此外，除了磷酸部修饰，还有糖部被修饰的应用（见图2），位于序列两个末端的数个碱基上导入了2''MOE（2''-Methoxyethyl）修饰的寡核酸已经在上市的核酸药物中被采用。

      核酸药物的开发和品质管理需要高灵敏度、高选择性的分析方法，其中之一就是LC/MS的检测。在寡核酸的分析中经常使用离子对反相模式，但是离子对试剂容易残留在设备中，从而造成灵敏度降低的问题。另外，在离子交换模式中，流动相必须使用高浓度的盐，不适合LC/MS的测试。

      本研究使用的Shodex HILICpak VN-50色谱柱是新开发的高性能HILIC（亲水性相互作用色谱）色谱柱。填料使用多孔性聚乙烯醇微粒键合二元醇基，非常适合LC/MS的分析。如下介绍VN-50 2D色谱柱（内径2.0mm），不使用离子对试剂，使用较低浓度的挥发性盐溶液和乙腈混合溶液作为流动相，分析化学修饰后的寡核酸等的应用实例。此外，还将介绍使用内径1.0mm的VN-50 1D（特别定制）色谱柱进行高灵敏度分析的应用实例。

图1.核酸的磷酸部修饰

图2.核酸的糖部修饰

      LC/MS仪器使用Shimadzu Nexera/LCMS-8030 Plus，色谱柱使用Shodex HILICpak VN-50 2D（2.0mm I.D.×150mm，柱管材质：PEEK）以及VN-50 1D（1.0mm I.D.×150mm，柱管材质：SUS内PEEK）。填料粒径5μm，孔径100Å。流动相是(A)甲酸铵水溶液和(B)乙腈高压混合的溶液，混合比例做了各种探讨。色谱柱温度40℃，检测器使用UV(260nm）后接MS，MS的离子化法使用ESI，检测模式SIM（-）。

1.各种寡核酸的分析

      确认了磷酸化寡核酸和未修饰的寡核酸的洗脱差异。将合成寡DNA20mer（样品1），合成磷酸化硫代寡DNA20mer（样品2），合成寡RNA20mer（样品3），合成磷酸化硫代RNA20mer（样品4）分别用超纯水溶解配成0.1mg/mL溶液使用。

2.糖部修饰型寡RNA的分析

      确认了2''位修饰的寡RNA和未修饰的寡RNA的洗脱差异。核酸糖部全被2''MOE修饰的磷酸化硫代寡RNA20mer（样品5），两末端5碱基被2''MOE修饰的磷酸化硫代寡RNA20mer（样品6），核酸糖部全部被2''-OMe（2''-O-Methyl）修饰的磷酸化硫代RNA20mer（样品7），分别用超纯水溶解成0.2mg/mL的溶液使用。

3.VN-50 1D和VN-50 2D的灵敏度比较

      为了提高LC/MS的灵敏度，分别使用内径1.0mm的VN-50 1D色谱柱和内径2.0mm的VN-50 2D色谱柱进行了分析比较。将样品6使用超纯水溶解成0.2mg/mL的溶液使用。

4.寡DNA 10~50mer的分析

      进行了~50mer的寡DNA分离确认。合成寡DNA10mer（样品8），合成寡DNA20mer（样品9），合成寡DNA30mer（样品10），合成寡DNA40mer（样品11），合成寡DNA50mer（样品12），分别用超纯水溶解成0.02mg/mL的溶液备用。

      所有本研究用的样品见下表。

表1.本研究使用的寡核酸