糖尿病治疗药物的HPLC分析

      医药品根据处方目的、作用对象等有各种各样的化学结构。目前还没有能够对多肽、糖、小分子化合物等特性不同的糖尿病治疗药物同时分析的HPLC系统，需要根据各自的特性选择合适的色谱柱、设备及分析条件。

      本文介绍Shodex色谱柱分析糖尿病治疗药物的应用实例。

      二甲双胍作为一种口服糖尿病治疗药物，通过抑制体内糖生成从而起到降低血糖的作用。此外，二甲双胍还具有延长寿命的功效，相关研究正在进行中。

在研究二甲双胍的多种功效，并将研究结果应用于治疗之前，需要高灵敏度、高选择性的分析方法。

      图1为二甲双胍的结构式。由于二甲双胍的极性非常高，所以在反相色谱中很难保留，在分析高极性物质时，HILIC模式是一种非常有效的手段。

*图1.二甲双胍

      以下为使用Shodex色谱柱，运用HILIC分离模式分析二甲双胍的应用实例，可以配合三重四级质谱仪进行高灵敏度检测。

      20世纪初被发现的胰岛素作为糖尿病的治疗药物至今仍发挥着重要作用。众所周知，胰岛素可以形成二聚体和六聚体，它们与单体胰岛素不同，没有降低血糖的效果。因此，胰岛素制剂中所含的单聚体和二聚体的分离定量非常重要。

2-1.实验方法

      以下是分析方法。

      Shodex PROTEIN KW-802.5是填充了5μm粒径硅胶填料的水溶性SEC色谱柱。符合L20规定的填料粒径“5~10μm”色谱柱要求。

Column temp.规定为“Ambient”，但为了再现性设定为25℃。

系统适用性使用的溶液按照规定配置。将胰岛素（牛）溶解在0.01N HCl aq.中，使其达到4mg/mL浓度。这种胰岛素被要求含有0.4%以上的“high molecular proteins”(即二聚体或六聚体）。进样量为100μL。

2-2.结果和考察

      实验谱图见图4。

图4.胰岛素（牛）的谱图

      假设图中峰值1、2、3的峰值面积之和为100%，计算图中峰值1与峰值2的面积之比为9.1%。满足了规定指定的0.4%以上的要求。

从系统适用性上来看，胰岛素复合体13~17min，胰岛素二聚体约17.5min，胰岛素单体18~22min被洗脱，要求二聚体和单聚体之间的谷高度比2.0以上。

图中峰值1为胰岛素复合体，峰值2为胰岛素二聚体，峰值3为胰岛素的单体，保留时间基本与规定一致，峰谷比的实验值在10.0以上。

2-3.结论

      使用Shodex PROTEIN KW-802.5色谱柱可以满足系统适用性的要求，分析胰岛素。

      利拉鲁肽是促进胰腺胰岛素分泌的2型糖尿病治疗药物。其结构式一部分酰基化的肽，具有与体内分泌的GLP-1相似的结构。利拉鲁肽的分子量为3751，而GLP-1的分子量为4170。

      利拉鲁肽可以像胰岛素等其它肽、蛋白质一样利用尺寸排阻色谱柱分离其和二聚体。因此，尝试用Shodex PROTEIN KW-802.5来分离利拉鲁肽和二聚体。

3-1.实验方法

      实验条件如下。

      Shodex PROTEIN KW-802.5是硅胶基质尺寸排阻色谱柱。样品溶液使用利拉鲁肽制剂稀释5倍后使用。另外，为了更清楚地观察单体和二聚体的分离情况，还分析了加热后的溶液。把利拉鲁肽制剂在80℃加热17hr，5倍稀释后使用。进样量为5μL。

3-2.结果和考察

      实验谱图见图5。

图5.利拉鲁肽制剂的谱图

      图中1为利拉鲁肽，2为利拉鲁肽制剂中的酚。在1的单体前面的峰为二聚体和三聚体，均为加热后产生的。

在加热前后，单体和二聚体的分离度均达到了2.4。

3-3.结论

      Shodex PROTEIN KW-802.5可以分离出利拉鲁肽制剂中以单体和二聚体为主的聚合物以及添加的酚。

      艾塞那肽是促进胰腺胰岛素分泌的2型糖尿病的治疗药。具有与前文提到的利拉鲁肽相似的效果。

     美国药典中有两个相关的专论“Exenatide”和“Exenatide Injection”。里面规定了很多不同的检查项目及要求。本文是根据“Exenatide Injection”规定的“Assay”项目进行了适用性确认。

4-1.实验方法

      根据以下专论的条件进行分析。

      Shodex PROTEIN KW-802.5是硅胶基质尺寸排阻色谱柱。

      样品溶液使用“System suitability solution”和“Standard solution”专论中规定的。“Standard solution”是以0.25mg/mL将艾塞那肽溶解在“Diluent”中。“Diluent”是将3.26g/L的乙酸钠三水合物、2.98g/L的L-蛋氨酸、2.06mL/L的冰醋酸溶于2L水中的溶液。

      “System suitability solution”是将30μL“Soybean trypsin inhibitor stock solution”和1mL“Standard solution”混合。“Soybean trypsin inhibitor stock solution”是将大豆胰蛋白酶溶解成1mg/mL的溶液。对于大豆胰蛋白酶的峰值面积，是将所有峰面积相加记为100%，要求在2%~5%的范围内。

      进样量为20μL。在专论中规定了自动进样器的温度设定，测量数据时设置为8℃。

4-2.结果与考察

      “System suitability solution”测试谱图见图6。

图6.System suitability solution的谱图

      图中1是大豆胰蛋白酶，2是艾塞那肽。所有峰面积记为100%，大豆胰蛋白酶的峰面积为2.8%。

      艾塞那肽和大豆胰蛋白酶的分离度在1.3以上，符合规定的要求。

      “Standard solution”测试谱图见图7。

图7.“Standard solution”的谱图

      该标准规定，拖尾因子在0.8~1.4之间，峰面积相对标准偏差在2.0%以下，经确认，符合要求。

      大豆胰蛋白酶的分子量约为20100，艾塞那肽约为4200。根据分子量大的先被洗脱的特征，可以认为是按照专论计划的尺寸排阻模式进行分离。

4-3.结论

      Shodex PROTEIN KW-802.5可以符合美国药典“Exenatide Injection”规定的“Assay”项目进行艾塞那肽的分析。