磷酸化糖的LC/MS同时分析

LC/MS设备：Shimadzu Nexera/LCMS-8030 Plus

色谱柱：Shodex HILICpak VT-50 2D

(2.0mm I.D.×150mm;particle size 5 μm；pore size100Å）

              Shodex HILICpak VG-50 2D

(2.0mm I.D.×150mm;particle size 5 μm；pore size100Å）

      各色谱柱的填料模型图如图1所示。两种色谱柱的填料均使用聚乙烯醇基质，VT-50 2D键合了季铵官能团，VG-50 2D键合了氨基官能团。由于磷酸化糖具有容易发生金属配位的性质，所以两款色谱柱都是用PEEK的管材，防止由于金属配位造成的吸附以及峰型拖尾等问题。流动相的组成和流速等详细条件见各谱图的记载。MS的离子化使用ESI，检测模式使用SIM(-)和MRM(-)。设备中的线路管请尽量选用PEEK管，色谱柱使用PEEK管（0.1 mm I.D.）直接连接MS检测器。

图1. VT-50和VG-50的填料模型图

结果

图2.各种磷酸化糖的结构式。

      G1P、G6P、F1P、F6P是同分异构体，MRM检测时选择的离子相同，所以即使是使用MS分析也需要用液相色谱先进行分离。流动相使用25mm甲酸铵水溶液/乙腈=80/20，分离效果如图3所示。在检测模式中，MRM的灵敏度更高，在0.005~0.5μM的范围内，包括图中所示的G6P和F6P在内的所有物质均获得了高直线型的检量线。在这个条件下乙腈比例很低，所以磷酸化糖主要在阴离子交换模式下被分离，而不是HILIC模式。四种异构体磷酸化糖的洗脱位置不同的原因尚不明确，但有可能是因为水合离子半径的不同。

图3.使用HILICpak VT-50 2D进行G1P,G6P,F1P,F6P的同时分析

      在此条件下，不仅仅可以分析磷酸化糖，糖酵解的中间体之一二羟基丙酮-3-磷酸也能同时分析（在F1P后洗脱）。另一方面，对于具有两个磷酸基的F1,6bP和UDP-GIc，很难在这种洗脱条件下被洗脱。因此研究了提高甲酸铵浓度的梯度方法，如图4所示，确认了同时分析的可能性。

图4.使用HILICpak VT-50 2D进行G1P,G6P,F1P,F6P,F1,6bP，UDP-GIc的同时分析

2.使用HILICpak VG-50 2D进行磷酸化糖的分析

      使用VG-50 2D可以在碱性条件下分析磷酸化糖。图6为果糖、葡萄糖、G1P、G6P、UDP-GIc、F1,6bP同时分析的实验谱图。流动相是0.5%氨水和乙腈的混合溶液。乙腈的初始比例设定为80%，然后逐渐提高氨水比例，可以实现磷酸化糖和非磷酸化糖的同时分析。非磷酸化糖果糖和葡萄糖通过高乙腈比例可以在HILIC模式下被分离和洗脱，非磷酸化糖被洗脱后，通过提高氨水的比例，提高流动相的碱性，可以洗脱磷酸化糖。较高的乙腈比例有利于促进ESI中的离子化。碱性条件在离子化时还能促进糖类的去质子化，因此还能提高灵敏度。两种化合物在0.02~0.5μM的范围内均有良好的直线性。

图6.使用HILICpak VG-50 2D进行果糖、葡萄糖、G1P、G6P、UDP-GIc、F1,6bP的LC/MS同时分析

      此外，使用VT-50 2D进行分析分析，F1P、F6P、G1P和G6P四个组分的分离时间非常接近，因此使用该条件很难进行这些样品的同时分析。另外，由于设备也需要pH12左右的耐碱性，所以根据样品的组成和设备，需要和VT-50 2D的分析条件区分使用。

结论

      使用聚合物基质键合了季铵官能团的HILIC色谱柱Shodex HILICpak VT-50 2D以及聚合物基质键合了氨基的HILIC色谱柱Shodex HILICpak VG-50 可以利用LC/ESI-MS模式，不添加离子对试剂，不需要衍生，通过简单的实验条件进行磷酸化糖的高灵敏度分析。

      使用VT-50 2D色谱柱，可以利用阴离子交换模式进行四种磷酸化糖异构体的分析，通过调整盐溶液浓度，也可以分析二磷酸化糖。

      使用VG-50 2D色谱柱可以在碱性条件下主要利用HILIC模式进行磷酸化糖和非磷酸化糖的同时分析。

      这些色谱柱分析磷酸化糖的特性和实验条件各不相同。可以根据样品的组成和使用的设备选择合适的分离条件，对生物体内的能量代谢关键物质磷酸化糖进行高灵敏度同时分析。