2022-01-21 10:42:20, 沃特世 沃特世科技(上海)有限公司
放疗是头颈部肿瘤的标准治疗方法,能显著提高患者的长期生存率,但在有头颈部肿瘤病史的患者中,接受过放疗的患者中发生颈动脉狭窄(CAS)的比例为70%,而未接受放疗的患者中发生CAS的比例不到4%。明确放射治疗CAS的病因和病理作用对CAS的诊断和治疗有重要意义。
近期首都医科大学宣武医院神经外科即中国国际神经科学研究所发表在《Radiotherapy and Oncology》期刊的研究中采用脂质组学策略来比较辐射诱导颈动脉斑块(RICPs)和颈动脉粥样硬化斑块(ASCPs)之间的代谢差异,并使用DESI-MSI来表征脂质的空间分布。相较此前已有的利用MALDI和SIMS方法,获得了更加清晰的生物标志物空间分布,为全面阐明辐射致血管损伤的机制,并确定预防辐射致血管损伤的措施提供了有力支撑。
放疗诱导的颈动脉斑块组(RICPs )8例和动脉粥样硬化型颈动脉斑块组(ASCPs)12例。手术切除后,2个RICPs和2个ASCPs样品在冷冻切片机上获得切片,储存在-80℃下进行DESI-MSI和免疫染色。这些样品的剩余组织,以及6个RICPs样品和10个ASCPs样品经均质离心后进行UPLC-QTOF-MS代谢组学分析(图1)。
01
UPLC-QTOF-MS:
质谱分析采用Waters UPLC-Xevo G2-XS QTof超高效液相色谱系统结合四极杆飞行时间质谱进行。色谱柱为ACQUITY UPLC CSH C18(2.1 mm*100 mm, 1.7 μm),采用正离子和负离子两种模式进行数据采集。
02
DESI-MSI:
质谱数据采集采用Waters SYNAPT G2-Si HDMS Q-TOF,以95%甲醇-5%水作为DESI喷雾溶剂,流速2 μL/min,采集质量范围m/z 50-1200,毛细管电压4.5 kV;源温150℃;雾化气氮气压力为0.45 MPa,空间分辨率80 μm。数据处理软件为高清成像软件HDI(High Definition Imaging)。
03
免疫染色:
将DESI-MSI成像分析后切片用油红O染色, 相邻切片进行Masson三色染色。
图1. UPLC-QTOF-MS和 DESI-MSI实验流程示意图
采用UPLC-QTOF-MS结合OPLS-DA模型比较RICPs和ASCPs的代谢谱。在正离子和负离子模式下基于VIP>1, P<0.05, FC>1.2, 确定了31种在RICPs中显著上调的代谢物(图2)。
图2. 辐射诱导颈动脉斑块(RICPs)和颈动脉粥样硬化斑块(ASCPs)样本在正离子(A-C)和负离子(D - F)模式下的正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)得分图、S-plot图和火山图。
在31种代谢物中,6种甘油三酯[TG(17:2/17:2/18:0),TG(17:1/17:2/18:0)、TG(17:0/17:2/18:0)、TG(17:2/17:2/20:0)、TG(17:1/17:2/20:0)、 TG(15:0/22:0/22:2)]在区分两种斑块方面表现良好,DESI - MSI显示胆固醇油酸酯[CE(18:1)]和胆固醇亚油酸酯[CE(18:2)]均匀分布在高丰度的斑块中(图3C),6个TG位于胶原纤维区域(图3D),RICPs胶原纤维区6种TGs的离子强度高于ASCPs,这与UPLC QTOF-MS的结果一致(图4)。这些结果为区分RICP和ASCP提供了潜在的生物标志物。此外,利用代谢通路分析发现脂质代谢异常、免疫和炎症反应可能参与了RICPs的发生机制。辐射后血管中脂质的消化、吸收、合成和分解均出现异常。研究中观察到的 RICPs中TGs的代谢异常可能与血管衰老和慢性炎症有关。
图3 . (A)解吸电喷雾电离质谱成像(DESI-MSI)扫描后,用油红O染色结果;(B)相邻切片用Masson三色染色结果;(C) DESI-MSI测定的胆固醇油酸酯[CE(18:1)]和胆固醇亚油酸[CE(18:2)]在RICPs和ASCPs中的分布;(D) DESI-MSI确定的RICPs和ASCPs中TGs分布。
图4. UPLC-QTOF-MS 方法得到的6种关键诊断标记物甘油三酯离子强度的Violin图,RICPs:辐射诱导颈动脉斑块,ASCPs:颈动脉粥样硬化斑块。
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代谢组学技术是一种发现生物标志物的有力方法,但无法获得代谢产物的空间分布信息。质谱成像(MSI)技术可以将代谢产物原位映射到组织,利用UPLC-QTOF-MS和DESI-MSI将传统代谢组学与空间组学相结合,同时DESI-MSI相对无损的检测方式使得质谱成像分析后的样本可继续进行后续H&E染色及免疫组化等分析,获得同一样本的多维度分析结果,为研究疾病的发生发展及预防工作提供了新的可靠的科研利器。
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