2021-12-16 09:15:33, 德国耶拿生命科学 德国耶拿分析仪器股份公司生命科学
全球性新冠疫情的爆发,让以荧光定量PCR(qPCR)为核心的核酸检测技术“出圈了”。殊不知,qPCR除了可以扩增检测核酸外,对蛋白质的研究也有独到之处。
做蛋白质研究,如何确保蛋白质稳定性是绕不开的课题。蛋白质的稳定性一般取决于和配体的相互作用、缓冲液条件以及构象的变化,要摸索优化这些条件非常耗时费力。如果我们把qPCR的核酸熔解曲线实验原理转移到蛋白质研究中,就可以很方便地在荧光定量PCR仪上通过蛋白质热漂移Thermal shift实验进行蛋白热稳定性的研究,只需把核酸荧光染料换成蛋白质标记常用的SYPRO Orange即可。
SYPRO Orange荧光染料是一种自然猝灭的染料,蛋白质变性后,它能高效地结合到暴露出来的蛋白质疏水核心,进而发生荧光信号的增强。蛋白质在不同状态下,其熔解温度Tm会有不同,通过比较不同条件下蛋白质Tm值的变化,便可知道蛋白质是否发生变性。该方法操作简单,灵敏度高,反应快速,是拓展荧光定量PCR仪应用的一个新方向。
图1、SYPRO Orange 结合蛋白质疏水核心,进而发出荧光信号
图2、蛋白质熔解曲线原理示意图
我们以一个简单的实验案例来看一下,如何用荧光定量PCR仪检测蛋白质热稳定性。本实验研究的目标蛋白质是溶解在TBS中的α-胰凝乳蛋白酶原A,检测在3种浓度不同的NaCl溶液下,其蛋白Tm值的变化情况。
表1、样品反应体系的配置(20μl /孔,每种NaCl浓度3个复孔)
图3、蛋白质熔解曲线反应程序(以耶拿qTOWER3G为例)
实验结果:
图4、三种NaCl溶液下的α-胰凝乳蛋白酶原A的熔解曲线:20 mM(灰色)、500 mM(黑色)、2 M(红色)
表2、三种NaCl溶液下的熔解温度Tm值
结论:
从熔解曲线的结果可以明显看出,随着NaCl溶液浓度的提高,α-胰凝乳蛋白酶原A的热稳定性也随之提高,20 mM时的Tm值为49℃左右,2 M时的Tm值在55℃左右,Tm值大约漂移了6℃。我们还可以进一步探讨引起热稳定性提高的原因,比如说较高的盐浓度可导致α-胰凝乳蛋白酶原A的水化壳的形成,由此提高了蛋白稳定性。
蛋白质热漂移实验是检测蛋白质热稳定性的简便快速的方法,有助于评估蛋白质配体结合、最佳缓冲液条件或分析蛋白质构象变化等。
荧光定量PCR仪是开展蛋白质热漂移实验的优选工具。
1. 高通量:可同时进行96个乃至384个样品的检测。
2. 检测快速:反应时间只需要十来分钟。
3. 操作简单:反应体系的配制比qPCR实验还简单,反应程序只需调用熔解曲线。
4. 低成本:SYPRO Orange是易获得的常规的荧光染料。
当然,并不是所有荧光定量PCR仪都适合做蛋白质热漂移实验,还需要考虑重要的两个方面:
1. 仪器上必须要装配有专用于SYPRO Orange的检测通道。
2. 仪器的温控精准度必须要高,能有效区分开不同情况下蛋白质Tm值的差异。
德国耶拿公司出品的荧光定量PCR仪qTOWER3系列,能根据客户需求灵活配置检测通道,提供专门的SYPRO Orange蛋白检测通道,温度准确性±0.1℃,温度均一性±0.15℃,中文软件简单直观,是开展蛋白质热漂移实验的理想之选。
07-01 英斯特朗
连载 | 药物一致性评价与粒度分析(三)07-01 欧美克仪器
【仪器百科】LS-909丨干湿二合一激光粒度分析仪07-01 欧美克仪器
标准物质解决方案 | PFASs(全氟及多氟化合物)06-29
第九期阿尔塔有约 | 环境专题【新污染物:PFAS】技术研讨会精彩回顾及提问解答06-29
“绿色技术范式”,分析化学未来发展方向——访中国分析测试协会副理事长、辽宁省分析科学研究院原院长刘成雁教授06-29 转载仪器信息网
华西医院-标准型数显脑立体定位仪、双通道体温维持仪、体式显微镜安装完成06-29 迈越生物
科鉴检测助力2家仪器企业获得首批产品可靠性认证证书06-28 科鉴检测
德国耶拿:锂电池生命周期分析解决方案06-28 德国耶拿
AI已来!生命科学本科教学如何紧跟技术浪潮06-28 Opentrons
盛瀚售后,五星级服务的秘诀是什么?06-28 SHINE
专为汽车制造商打造的柔性解决方案——实现制程控制06-28
西北工业大学-脑立体定位仪安装完成06-28 迈越生物
会议邀请 | 第九届海上检验医师论坛06-28
卓立要闻 | 创新发展ing…6月卓立“大事小情”速览06-28 光电行业都会关注
打造信任合作伙伴!2024年度卓立汉光客户满意度调查开启06-28 光电行业都会关注
如何挑选适用于三阶光学非线性的测量系统?Z扫描测量系统来助力!06-28 光电行业都会关注
招聘启事—中国科学院沈阳自动化研究所微纳光学测量表征技术课题组06-28 光电行业都会关注
谱育科技作为主要完成方 荣获2023年度国家科学技术进步一等奖和二等奖06-28 点击关注→
仪器原理丨顶空仪与吹扫捕集仪科普小知识06-28 天美色谱