斑马鱼成像：LESA-MS 全氟化合物 PFASs 轮廓分布研究

斑马鱼和人类基因有着87%的高度近似性，作为模式生物优势突出，其实验结果多能适于人体。也常用于水质环境监测。

3-6个月的成年雌性斑马鱼（Danio rerio），在适应实验环境两周后，暴露于20 μg/L 全氟辛酸（PFOA）或全氟辛基磺酸（PFOS）水溶液中。对照组与暴露组同等喂食。

28天后，对所有斑马鱼处以安乐死，以 150 mg/mL 明胶溶液和 2% CMC（羧甲基纤维素）水溶液包埋处理，冷冻切片，整片斑马鱼切片厚度为 50 微米。

LESA，即（芯片）多通道纳喷源（Triversa NanoMate）的四合一模式中的第四种，液滴萃取表面分析。

条件优化后，选择 MeOH/H₂O/NH₄Ac（70:30:1，v/v/v）为萃取剂，萃取剂体积 1.0 微升，萃取时间5秒，萃取2次，喷雾时间30秒。纳喷电压1.4 kV，萃取高度0.8 mm

联机质谱以负离子模式扫描，质量范围为 m/z 300-500，分辨率为 6 万。

通过 LESA-MS 分析 PFOA 和 PFOS 标准液以构建校准曲线。萃取剂中添加¹³C₄-PFOA 和¹³C₄-PFOS（1 μg/L）作为同位素标记内标物。

以 PFOA（m/z 412.9665）和 PFOS（m/z 498.9792）的精确质量数实现0.1-50 μg/L 的精确定量，相关系数 R² 分别为0.9985和0.9992。PFOA 检测限和定量限可达6.7 pg/L 和15.1 pg/L，PFOS 为22.2 pg/L 和50.3 pg/L。重现性良好，RSD（n=5）分别为9.5%和8.0%，该定量方法可用于分析组织切片上分析物的含量。

由于斑马鱼不同部位的基质效应可能不同，研究组引入了校正因子 α 来消除这部分误差。斑马鱼的全身组织切片可分为六个区域，即脑（brain）、卵（roe）、肌肉（muscle）、器官（organ）、鳃（gill）和腹鳍（pelvic fin）。

斑马鱼冷冻切片结构

在空白玻片和空白斑马鱼组织切片的六个部位，分别滴加1 μL（0.5，5，10 μg/L三种浓度）的 PFOA 或 PFOS 标准溶液。溶剂蒸发后，用含内标的萃取剂萃取，随后进行 LESA-MS 分析。斑马鱼上萃取得信号 I_A 与玻片上信号 I_IS 的比值即为校正因子 α。此因子与浓度无关。

研究发现，脑和肌肉部位的基质效应较小，而鳃、器官和卵的基质效应较大，引入 α 校正后，信号得以明显提升。

在计算校准因子后，应用 TSF 策略校正斑马鱼组织不同部位的基质效应，获得真实的分析物含量。如图，斑马鱼各部位 PFOA（左）和 PFOS（右）信号在引入校正因子 α 的前后变化。

LESA-MS 可快速且高敏提取痕量分析物。通过成像发现两种 PFASs 在斑马鱼体内都有明显的分布差异，其浓度从高到低依次为鳃、器官、鱼卵、腹鳍、肌肉和大脑。

鳃是斑马鱼通过呼吸交换接触外源物质的首要区域，也是鱼类代谢的重要场所。PFASs 可破坏膜的结构完整性，并以亲脂长碳链结构的形式在细胞内积累，因此在脏器区域即心脏、肠道、肝脏、肾脏和胃的富膜区呈蓄积模式。大脑具有高度选择性的屏障防御系统可抵御有毒物质入侵，不过， LESA-MSI 结果显示，斑马鱼脑内也有 PFASs 积累，提示 PFASs 有穿透血脑屏障的能力。另外，在雌性斑马鱼的鱼卵中也发现了 PFASs，存在从母体转移到后代的生物积累风险。

PFOA 和 PEOS 分别在斑马鱼体内的含量分布

本研究利用 LESA-MSI 实现斑马鱼体内 PFASs 的快速高敏的原位质谱成像，定量能力优异，成功勾勒出斑马鱼组织中的 PFOA 和 PFOS 的空间分布规律。LESA-MS 结合 TSF 策略，为监测生物体内环境污染物的含量分布提供了高效可靠的方法。