恒光讲堂｜NaGdF4纳米探针：用于靶向细菌的NIR-II光声成像

2021-11-17 19:00:23, 恒光智影上海恒光智影医疗科技有限公司

本文要点：细菌感染严重危害人类生命与健康，在感染早期及时诊断并治疗可以减轻患者痛苦甚至挽救生命，现有的技术手段可以检测区分细菌种类，但耗时过长，浪费了宝贵的治疗时间。因此作者合成了一种适用于诊断体内细菌感染的荧光探针DCNPs。该探针在近红外二区窗口下，拥有高荧光强度和深穿透性。同时，作者将该探针与万古霉素共价结合后（DCNPs-Van），探针能够与革兰氏阳性细菌特异性结合。在体外实验和体内实验验证中，万古霉素修饰后的探针可以对革兰氏阳性细菌和革兰氏阴性细菌加以区分，实现体内细菌感染的早期快速诊断。

纳米探针DCNPs-Van合成示意图及体内细菌感染的光声成像示意图（图 1）。

图 1：(a) 探针DCNPs-Van的合成路线。(b)基于DCNPs-Van的体内革兰氏阳性细菌靶向成像示意图。

首先，DCNPs的亲水侧暴露出的羧基（-COOH）可以和万古霉素的氨基（-NH2）共价结合，变成可以靶向细菌的纳米探针（DCNPs-Van）。电镜下观察两种纳米粒子，OA-DCNPs和DCNPs-Van均呈单分散，且DCNPs-Van的形态和粒径与OA-DCNPs相比差异较小，表明其结晶性良好（图 2）。

图2：(a) OA-DCNPs和(c) DCNPs-Van的TEM图像。(b) OA-DCNPs和(d) DCNPs-Van粒径分布图像。

对纳米探针测定其发射曲线，发现NaGdF4:5 %Nd NPs在1060 nm 和1330 nm处均有发射带（图 3a）。同时因为减少了纳米粒子表面的淬灭剂，NaGdF4:Nd@NaGdF4核壳型NPs下转换发射强度强于NaGdF4:5 %Nd NPs。接下来，作者探究了Nd 3+离子浓度对NaGdF4:Nd@NaGdF4核壳型NPs下转换荧光强度与晶体结构的影响。当增加Nd 3+离子到10 %时，依然没有改变其发光强度（图 3b）。此外，NaGdF4:5 %Nd NPs也表现出了很高的量子产率，接近28.5 %（图 3c），这一数值超过了大部分镧系的商用染料。

图3: (a) NaGdF4:5 % ND和NaGdF4:5 %Nd@NaGdF4NPs的发射光谱。(b) NaGdF4:xNd@NaGdF4 NPs (x = 1,3,5,8，或10%)发射光谱。(c)在808 nm激光激发下，OA-DCNPs在环己烷中和DCNPs-Van在水中的发射光谱。(d) Van、PAA-DCNPs和DCNPs-Van的紫外-可见吸收光谱。

接下来，作者便将DCNPs-Van与革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌共孵育，在电镜下可以观测，探针逐渐与细菌表面结合（图 4a-d）。为了验证探针的特异性，作者选择革兰氏阴性细菌大肠杆菌作为对照，分别将不同浓度的大肠杆菌与金黄色葡萄球菌共孵育，对沉淀和上清液进行NIR-II光声成像（图4e-j）。随着金黄色葡萄球菌浓度增高，沉淀的荧光信号加强，而上清液中荧光信号逐渐减弱。而在大肠杆菌光声成像中，沉淀的荧光强度和上清液的荧光强度都不会随着细菌浓度的改变而改变。证明DCNPs-Van可以与革兰氏阳性细菌特异性结合。

图4：(a, b)金黄色葡萄球菌和(c, d) DCNPs-Van标记后金黄色葡萄球菌的SEM图像;(e)金黄色葡萄球菌悬液和(h)大肠杆菌悬液在808 nm激发(300 mW/cm2)下的NIR-II光声图像;(f)金黄色葡萄球菌悬浮液、(g)金黄色葡萄球菌上清液、(i)大肠杆菌悬浮液和(j)不同细菌浓度下的大肠杆菌上清液荧光强度变化曲线图。

接下来，作者又探究了DCNPs-Van在体内NIR-II光声成像的效果。首先作者将PAA-DCNPs分别注射到感染金黄色葡萄球菌与大肠杆菌的小鼠体内，在感染部位均未观察到荧光信号（图5 a，b）。然后，作者又将DCNPs-Van注射到两种小鼠体内，在金黄色葡萄球菌感染小鼠体内，注射探针6 h后，感染部位出现明显的荧光信号，直至24 h。而大肠杆菌感染小鼠未见荧光信号（图5 c-e）。

图5：在808 nm激光激发下，不同模型小鼠的NIR-II光声图像（300 mW / cm2）。（a）PAA-DCNPs注射到金黄色葡萄球菌感染小鼠体内。（b）PAA-DCNPs注射到大肠杆菌感染小鼠体内。（c）DCNPs-Van注射到金黄色葡萄球菌感染小鼠体内。（d）DCNPs-Van注射到大肠杆菌感染小鼠体内。

作者又探究了探针在体内的生物相容性。通过MTT测试，当DCNPs-Van浓度达到1000μg/ mL时，共孵育的NIH / 3 T3细胞（鼠胚胎细胞）活性在80 %，表明其具有良好的体外生物相容性（图6 a）。将DCNPs-Van注射到健康小鼠体内，荧光信号主要集中在肝脏中，且在注射后第九天，荧光信号消失，表明探针可以经过肝脏代谢（图6 b）。对小鼠进行组织切片观察，各器官与对照组小鼠相比无异常变化（图6 c）。