2021-10-08 18:59:20, 徐玲丽 美谷分子仪器(上海)有限公司
抗体药物的主要作用机制是通过 Fab 区与疾病相关的靶细胞抗原发生特异性结合,再通过 Fc 区发挥一系列的效应功能,包括 Fc 区域通过结合主要是 NK 细胞上的 FcγRIII(CD16A)引发抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCC);与血清补体分子(C1q)结合,继而形成膜攻击复合物(MAC)引发补体依赖的细胞毒作用(CDC);与巨噬细胞上的 FcγRIII(CD16A),FcγRII(CD32A)和 FcγRI(CD64)结合,可引发抗体依赖细胞介导的吞噬作用(ADCP),进而起到治疗的作用。有结合才会有功能,有功能一定有结合,结合和功能是抗体活性检测中最重要的两部分,所以在生物药前期研发阶段,包括细胞系建立的阶段,需要对抗体类药物的活性进行测定,以确保抗体类药物的有效性。
Mécanismes d’action et toxicités potentielles
des anticorps monoclonaux
Med Sci (Paris) 2019 ; 35: 1114–1120
一般用亲和力来表示抗体与靶点分子结合的情况,它是可逆反应过程中抗原、抗体和抗原-抗体复合物之间的相对状态的特征参数。对于抗体药物的效应功能测定,一般是基于细胞功能的检测,如检测细胞信号转导过程中关键生物标记物的信号;对引起细胞应答的转录和翻译水平的测定;以整个细胞为对象测定细胞的增殖或者死亡。
ELISA 和流式细胞术是目前检测抗体活性中常用的两种方法。如 ELISA 检测抗原抗体结合亲和力,一般将抗体与系列稀释的抗原一同在溶液中温育,进行抗原-抗体反应。当反应达到平衡后,将溶液移至包被有相同固相抗原的聚苯乙烯微板中,进行接下来的酶标二抗的孵育和显色。测得的 OD 值结合梯度稀释的抗原浓度绘制拟合曲线,最终找到最强信号一半的点,通过 IC50 值评价抗体的抗原结合能力。
ELISA 的主要操作步骤
但是 ELISA 步骤繁多,有大量的移液、清洗步骤,靠人工操作,难免会出现移液体积不准、漏加等人工操作误差导致的信号弱或者过饱和,以及标准曲线线性不佳、污染等问题。丹纳赫生命科学拥有自动化工作站结合酶标仪的整合方案,可以自动化地对样本进行高通量的 ELISA 操作,最大程度避免实验误差及重复的人工劳动。
自动化工作站进行 ELISA 实验流程
自动化工作站进行 ELISA 实验的结果
另外,还可以利用酶标仪的荧光偏振(FP)功能结合 ValitaTiTER 试剂实现快速、均相、精确地对 IgG Fc 结合产量进行有效评价。荧光偏振是一项广泛用于监测不断变化的结合事件的技术,可用于评估包括蛋白-抗体结合和 DNA 杂交在内的生物分子相互作用以及酶活性。通过平面偏振光激发的荧光标记小分子(示踪剂)可发射消偏振程度最高的光,这是因为示踪剂在激发与发射之间的间隔时间里快速减少。但当示踪剂结合一个比之大得多的分子时,它的旋转速度就会变慢,同时发射光仍然有大部分产生偏振。
在 96 孔微滴度板的每个孔中,都包被有荧光标记的 IgG 结合多肽蛋白 G。当加入样品到孔板中时,蛋白 G 分子被重悬并发生结合。一旦结合抗体,蛋白 G 分子的运动速率便会下降,导致荧光偏振 ( FP ) 值的增加。
荧光偏正原理
ValitaTiTER 实验流程
荧光偏振法 IgG 定量实验结果
这种 96 孔测定法已在 SpectraMax iD5 读板机和 Molecular Devices 的其他读板机上通过荧光偏振检测试验充分进行了验证,以确保结果可靠。SoftMax Pro 软件能自动进行标准曲线拟合和结果定量,最大程度减少检测的设置时间。
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