自动化高通量技术应用之 siRNA 文库筛选

2023-11-01 13:37:26, Viny 美谷分子仪器(上海)有限公司


随着生物药产业的不断发展以及高通量自动化技术的日新月异,以往在药物研发环节中耗时、耗力的DOE实验操作和生物检测与验证实验已经能够被多种自动化高通量的技术替代。例如现在市场上广泛使用的自动化核酸提取技术,一般96个样本不到30min即可完成;NGS以及微阵列等技术可以一次检测获得大量基因的序列或表达信息;利用质谱技术可以对大量的蛋白质进行分析和研究等。高通量自动化技术的应用可以显著提高药物的研发效率以及降低研发成本,如今越来越多的实验室开始了自动化、高通量、智能化的布局,在药物研发的赛道上争做领先人。

丹纳赫生命科学旗下多家运营公司拥有多种高通量自动化的技术和设备,并能根据实验目的实现灵活整合。

siRNA (Small interfering RNA)是一种双链小分子RNA(约21~25nt),可通过同源互补的方式与序列特异的目的基因mRNA 结合,从而对特定的目的基因进行降解,使细胞或机体产生基因沉默的表型。因此,根据目的基因的特定序列,可以人为设计特定的siRNA序列,实现目的基因的沉默。siRNA文库即是针对全基因组、某一类特殊基因或信号通路基因等设计合成,每个基因设计多对siRNA,组成预制型和定制型siRNA文库,用以进行特定功能基因筛选、解析复杂信号通路网络以及开发新的药物靶点。

对siRNA文库的筛选,需要在高密度的孔板中进行可靠和可重复的多因子细胞转染实验。采用丹纳赫生命科学旗下贝克曼库尔特生命科学带有HEPA过滤外壳的Biomek i7自动化工作站整合美谷分子仪器的带有 MiniMax 300细胞成像系统的SpectraMax i3X多功能酶标仪,并配置一个细胞培养箱,可完成细胞转染DOE以及转染效率分析的实验。在此过程中将自动化工作站的Span-8灵活8通道和96多通道的移液设备配合,系列稀释不同浓度的脂质转染试剂,并将多梯度的转染试剂与两种浓度的FAM标记的siRNA(siGLO Green)混合,得到的48个条件再复制到384孔板中,并添加两种不同密度的细胞,得到96个正交条件384孔板,每个条件包含4个重复。此过程中的138个移液操作步骤不到20分钟即可完成。

贝克曼库尔特生命科学的Biomek i7自动化工作站及其细胞转染DOE实验操作示意图

而丹纳赫生命科学旗下美谷分子仪器的SepctraMex i3x多功能酶标仪的MiniMax 300可以对转染效率和细胞毒性进行评估。用FAM标记的siRNA转染后24小时,加入DRAQ7以测量转染诱导的细胞毒性。MiniMax 300的细胞成像系统可进行转染细胞和死细胞的成像及计数,并通过软件数据分析以确定最佳转染效果。

总细胞成像(明场)

转染细胞成像 

(541nm荧光)

死细胞成像(713nm荧光)

叠加图

美谷分子仪器的SepctraMex i3x多功能酶标仪

另外,高通量成像与小体积移液系统也常常用于需要进行大量操作及分析的siRNA文库筛选的工作中。美谷分子仪器的ImageXpress Confocal HT.ai智能型共聚焦高内涵成像系统拥有 8 个成像通道的 7 色激光光源,可实现高扩展性的多通道成像分析,其配置的MetaXpress® 软件和 IN Carta ™ 软件的组合使用能够简化高级表型分类和 3D 图像分析的工作流程,并具有机器学习能力,支持亚细胞到整体组织水平的成像分析。另外,配套的湿度、CO2 水平、温度调控的环境控制模块可保持细胞的活力状态,以进行从几分钟到几天不等的延时实验。ImageXpress Confocal HT.ai 以此高配置条件在进行siRNA文库筛选中的高通量成像分析时,不但读取快还可以获得更深层次的数据。

美谷分子仪器的ImageXpress Confocal HT.ai

智能型共聚焦高内涵成像系统

针对小体积移液,使用贝克曼库尔特生命科学的Echo®声波纳米移液系统,只需纳升级别体积的siRNA以及转染试剂就可以完成高效率的细胞转染工作。Echo®移液工作站是结合了动态液体分析技术™(DynamicFluid Analysis™)和声波移液技术(Acoustic Droplet Ejection) ,将超声波能量聚焦于液体液面,使母板孔内的微量液滴转移至目标孔内,准确地移取各种液体。如将siRNA转染进SYKE细胞,采用Echo®声波纳米移液系统取10nL到1000nL的siGLO和转染试剂放入160μL(1.0×103)的 KYSE细胞中, 手动操作则加入20µL的siGLO和转染试剂,其他体积保持不变,24小时后,采用Cytiva的IN Cell Analyzer 1000 活细胞图像分析系统分析转染效率,Echo®声波纳米移液系统的效果要好于手动操作的效果。

声波转染及人工转染效果比对

贝克曼库尔特生命科学的Echo® 525 声波移液处理系统

自动化高通量技术不仅可以将技术人员从重复性操作中解放出来,避免了人为误差的发生,很大程度上提高了实验重复性,让药物研发速度和质量迈上更高的台阶,而且这些技术正推动着生物医药行业向数字化和智能化转型。

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