解密mRNA的“运载火箭” - 脂质纳米颗粒递送系统

  覆盖率、分离度、灵敏度均可兼得

LC-MS方法被广泛用于分离和分析不同来源的脂质，再将其归类为不同的脂质或分子类别。其中，正相色谱(NP)和亲水作用色谱(HILIC)是分离不同类别脂质的两种常用技术，而反相色谱(RP)则多用于分离同⼀类别但分子种类不同的脂质。

本研究使用ACQUITY Premier CSH C18 RP色谱柱分离LNP脂质成分，相比其他RP色谱柱，可提供更高的覆盖率和分离度。由于这些脂质的紫外吸光度较低，因此需要借助ACQUITY RDa高分辨质谱检测器来提高分析灵敏度。如图3所示：图3(A)为典型的提取离子色谱图；图3(B)则显示了四种代表性脂质的相应质谱图。DMG-PEG-2000的合并质谱图如图3(B)所示，在谱图中观察到多个电荷态（+2、+3和+4）。

图3. 正离子模式下的提取离子色谱图(A)和相应质谱图(B)。

  可详细鉴定出各脂质成分信息

为鉴定各脂质成分，我们首先在UNIFI科学库中创建了一个包含各种脂质化合物的自定义数据库（谱库）。UNIFI将比较和匹配预期模拟碎片与实验得到的HRMS碎片，以进行结构表征。如果需要，可以单击蓝色图标检查每个碎片离子谱图，并将其发送到UNIFI科学库以创建包含碎⽚离⼦信息的自定义脂质LNP数据库。图4显示了采用UNIFI成分分析工作流程的样品分析结果示例，包括成分概要、色谱图和质谱图。

图4. 成分概要图：(A)鉴定出的胆固醇、阳离子脂质MC3、DSPC和13种不同DMG-PEG-2000的脂质纳米颗粒；(B)DSPC的提取离子色谱图示例；(C)DSPC的低能量精确质量数 和(D)DSPC相应的碎片离子谱图。蓝色图标表示匹配的预期模拟碎片离子与实验得出的碎片离子。

所有已鉴定脂质的结果都会显示在成分确认表或成分图中。其中DMG-PEG-2000以不均一的多分散聚合物形式存在，并且包含长度范围从38到50个(CH2CH2O)单元不等的PEG链。基于PEG单元的多分散性，共鉴定出13种不同的PEG化脂质。 

图5. 已鉴定脂质纳米颗粒成分概要列表 (A)。

图6. 四种已鉴定脂质的成分图(B)。

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可电离脂质MC3、DSPC和DMG-PEG-2000的检测下限确定为5 pg/μL（柱上进样量25 pg），胆固醇的检测下限为250 pg/μL（柱上进样量1.25 ng）。 

图7. 直观显示不同浓度水平下可电离脂质MC3响应的概要示例图。

  可直观比较脂质批次差异

UNIFI中的二元比较功能可直接比较未知脂质样品与参比样品的分析结果。该功能可用于生成脂质原料或目标产品的LC-MS图谱，并显示为镜像对比图，以便区分类似产品，鉴别罕见杂质，或比较多个生产批次的脂质质量。另外，还可以使⽤该功能结合提取离⼦⾊谱图（图8A）或指定质谱图（图8C和8E）来⽐较未知样品中各脂质的丰度和参⽐样品的丰度，并显⽰为镜像对比图。图8A显示了仅在未知（即加标）样品中观察到的两个特有峰，保留时间分别为2.02 min和6.62 min，表明存在加入的DMG-PEG 2000和MC3脂质。色谱图差异图（图8B）显示了这两个仅在未知样品中鉴定出的峰。同样，图8D和图8F显示了仅在未知样品中存在的PEG和MC3。

图8. (A) 0.1 mg/mL Avanti牛肝脂质提取物（上图：参比样品色谱图中的成分含量）和加标有可电离脂质MC3及DMG-PEG 2000的0.1 mg/mL Avanti牛肝脂质提取物（下图：未知样品色谱图中的成分含量）的色谱图二元比较；(B) 参比样品和未知样品之间的色谱差异图（采用点到点扣除方法）；(C) DMG-PEG 2000的合并质谱图二元比较（保留时间2.02 min）；(D) 图7C中参比样品和未知样品之间的谱图差异图；(E) 可电离脂质MC3的合并质谱图二元比较（保留时间6.62 min）；(F) 图6E中参比样品和未知样品之间的谱图差异图。

  可采用复杂样品验证

采用该方法分析复杂牛肝提取物，检测了所有主要的溶血磷脂、磷脂和中性脂质（图9）。结果表明，该方法可同时测定LNP组成以及LNP配制过程中因潜在降解、氧化、水解、氢化、聚集和二聚体形成而产生的任何其他杂质，证明该方法具有分析更复杂脂质的能力。

图9. Avanti Polar Lipids牛肝总脂质提取物的代表性正离子模式总离子色谱图。（缩写：DAG, 二酰基甘油；TAG, 甘油三酯；PC, 磷脂酰胆碱；PE, 磷脂酰乙醇胺；PG, 磷脂酰甘油；PS, 磷脂酰丝氨酸；PI, 磷脂酰肌醇；Cer, 神经酰胺；SM, 鞘磷脂；Cho, 胆固醇；CE, 胆固醇酯。）

结合了高性能表面(HPS)技术和BioAccord系统开发的这种常规LC-MS方法，可快速、简单地表征和分析出LNP成分。DSPC、可电离脂质MC3和PEG化脂质的检出浓度为5 pg/μL，胆固醇的检出浓度为250 pg/μL。该方法可用于分析复杂的脂质提取物，不仅能检出所有主要脂质类别，还可同时分析出LNP中的四种脂质成分以及其它由合成过程、降解或原料污染产生的杂质，高效方便地应用于工艺开发和质量控制中。