SPEX2010-对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的筛选及Cry15Aa蛋白活性的研究

摘要：

本研究以Bt杀虫基因和菌株为材料，使用高通量组织研磨仪制备、质谱鉴定、PCR检测，对绿盲蝽进行杀虫活性筛选、测定及基因鉴定，发现了cry15Aa基因所表达的蛋白对绿盲蝽具有杀虫活性的同时，获得了对其具有杀虫活性的Bt新菌株，对绿盲蝽的生物防治具有重要的意义。

苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)含有的杀虫基因已被广泛应用于转基因抗虫作物中。转基因棉花自1996年商业化种植以来，全球种植面积持续增加，有效地控制了棉花害虫的为害，减少了化学杀虫剂的使用。我国于1998年开始商业化种植转基因棉花，仅2014年就种植了390万 hmz的转基因棉花，占棉花总种植面积的93%。

目前种植的转基因棉花品种只对鳞翅目害虫具有较好的防治效果，例如：棉铃虫(Helicoverpaar- migera )、烟芽夜蛾(Heliothis virescens )和棉红铃虫(Pectinophora gossypiella )、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua )、草地贪夜蛾(Spodoptera frugi-perda)等；而对半翅目的盲蝽(Heteroptera: Mi-ridae)等刺吸式害虫没有防效。由于转基因棉田的化学农药使用减少，减弱了对盲蝽等非耙标害虫的控制，使之从次要害虫逐渐成为Bt棉田的主要害虫，并且呈现逐渐加重的趋势。苏云金芽胞杆菌Mtx杀虫蛋白是一类与球形芽胞杆菌（Bacillus sphaericus）杀蚊蛋白同源的杀虫蛋白，包括Cry15、Cry23、 Cry33、Cry38、Cry45、Cry51、Cry60、Cry64等。其中，Monsanto公司发现的Mtx类杀虫蛋白TIC807 (Cry51Aa2)对豆英草盲蝽[Lygus hesperus (Knight)］和美国牧草盲蝽 [Lygus lineolaris (Palisot de Beauvos)］具有较好的杀虫活性。在我国，棉田主要为害的盲蝽有绿盲蝽(Apolygus lucorum MeyerDür)、牧草盲蝽[Lygus pratensis ( Linnaeus)］、中黑盲蝽(Adelphocoris suturalis Jakovlev)、三点盲蝽[Adelphocoris fasciaticollis Reuter)等几种， 并且有逐年加重趋势，而国内对盲蝽有效的Bt杀虫基因的研究尚未见正式报道。因此，开展对棉盲蝽具有杀虫活性的Bt菌株及基因筛选对棉花害虫的绿色防控具有重要意义。

本研究在建立绿盲蝽生物活性测定方法的基础上，利用本实验室分离保存的Bt菌株及其杀虫基因进行绿盲蝽杀虫活性筛选，获得一个对绿盲蝽有效的杀虫基因，最终筛选出20株对绿盲蝽具有活性的Bt菌株，并完成了对部分活性菌株杀虫基因和蛋白的鉴定。

1. 材料与方法

1.1试验材料

1.1.1菌株和质粒

本研究用到的菌株和质粒见表1。

1.1.2培养基

液体LB培养基：胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，NaCl 1%，调pH至7.0，121℃灭菌20 min。 1.1.3主要试剂和仪器

高分子量蛋白marker(high molecular mass range marker)与低分子量蛋白marker(low molecular mass range marker)购自伯乐(BioRad)公司；镍亲和层析柱填料(chelating sepharose fast flow)购自GE公司；胰蛋白酶(1:250)购自Amresco公司； BSA标准品购自Thermo scientific公司。

主要仪器包括：美国Spex公司高通量组织研磨仪 Geno/Grinder 2010、美国Beckman公司高速离心机Avanti J-26xp、德国Eppendorf公司台式离心机5415C、美国Bio-Rad公司Mini protein Ⅲ蛋白电泳仪、美国GE公司高效液相色谱系统AKTA avant 25、美国Cole-Parmer 公司超声波破碎仪CP750。

1.1.4供试昆虫

绿盲蝽由中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫研究组在室内周年饲养，饲养方法与条件参见陆宴辉等。

1.2 试验方法

1.2.1Bt蛋白对绿盲蝽的生物活性测定

将酶解消化后的Bt蛋白加入绿盲蝽人工饲料中，均匀混合后，制成胶嚢，对绿盲蝽进行生物活性测定，在生物活性测定过程中，每个处理设置了3个重复，每个重复接10头绿盲蝽若虫，将制成的胶嚢分别放入各自编号的透明玻璃指形管中（高 8.0 cm，直径2.0 cm），然后将1日龄若虫接入到试管中，接好若虫的试管用棉花塞封好，防止若虫逃逸，然后将试管置于人工气候箱中，温度为（26±1）℃，相对湿度为60%-70%，光照为L//D=14h //10 h。2d更换一次人工饲料，每天观察并记录绿盲蝽若虫存活的情况。

1.2.2 Cry15Aa蛋白的表达与提取

将携带Cr；y15Aa［13］基因的质粒pEfr15Aa转入大肠杆菌Rosetta（DE3）中，筛选阳性菌落，接种于 5mL LB液体培养基（含有氨苄青霉素和氯霉素）培养8h左右，转接入300mL  LB液体培养基（含有氨苄青霉素和氯霉素）中培养至A600为0. 5时，加入终浓度为1 mmol/L IPTG，分别在16、30℃下150r/min，12h，比较在16℃和30℃下,Cry15Aa 蛋白在大肠杆菌中的诱导表达量。Cry15Aa蛋白在大肠杆菌中的表达与提取参见Zhou等的方法。SDS-PAGE电泳分析Cry15Aa蛋白的表达情况。

1.2.3 Cry15Aa蛋白的亲和层析纯化

将Cry15Aa蛋白的可溶组分通过镍亲和层析柱， 进行亲和层析纯化，具体参见Guo等的方法。 SDS-PAGE检测洗脱下来目的蛋白Cry15Aa的纯度。

1.2.4 Cry15Aa蛋白对绿盲蝽的生物活性测定

Cry15Aa蛋白的凝胶过滤纯化：利用AKTA avant蛋白液相分析系统对经过亲和层析纯化得到的Cry15Aa蛋白溶液进行缓冲液的置换（脱盐除咪唑）。将目的蛋白以2 mL/min的流速通过G25脱盐层析柱，然后用置换缓冲液20 mmol/L Na2COs/ NaHCO3（pH 10.0）以2 mL/min进行洗脱，分体积收集样品进行SDS-PAGE检测并定量。

SDS-PAGE分析与定量：收集的蛋白样品进行 SDS-PAGE分析，SDS-PAGE分析参见萨姆布鲁克.J等的方法，并以BSA蛋白为标准、利用National Institutes of Health 的 Image J（1. 44）软件对蛋白条带 进行定量，参见Image J User Guide 1.44使用方法。

按照1.2.1所述的方法测定经凝胶过滤纯化的 Cry15Aa蛋白对绿盲蝽的生物活性。

1.2.5 Bt菌株杀虫蛋白的提取、酶解与纯化

Bt蛋白的提取：将活化的Bt菌株均匀涂布于LB平板上，30℃培养至菌体裂解。收集菌体，悬浮于30mL灭菌水中；置于高通量研磨仪，1600rmp、5 min进行振荡破碎；4℃、8000rmp离心10 min，弃上清；沉淀用30mL预冷的1 mol/L NaCl悬浮，高通量研磨仪振荡，离心，沉淀用15mL预冷的灭菌水悬浮，即获得胞晶混合物。加入15mL裂解液，高通量研磨仪振荡混匀（条件同上），4℃裂解过夜； 4℃、8000rmp离心10 min，转移上清液，加入1/10体积的4 mol/L NaAc （ pH = 4. 5 ），混匀，冰上放置1h；4℃、8000rmp 离心 10 min，收集沉淀，25 mL 预冷的灭菌水反复冲洗多次，最终收集的沉淀用 50 mmol/L Na2CO3（pH = 10. 0）溶液溶解。

酶解与纯化：取1.5mL蛋白样品，胰蛋白酶 （250 U）与蛋白样品以质量比1:10混合后，37℃温育3h；酶解后的蛋白样品4℃、15000 rmp离15 min,取上清液经G25脱盐柱去除胰蛋白酶、短肽等杂质。

1.2.6 Bt菌株蛋白的质谱鉴定

对绿盲蝽具有杀虫活性菌株酶解后的蛋白，进行SDS-PAGE分析，切取部分蛋白条带送往北京华大蛋白质研发中心有限公司进行质谱鉴定。

1.2.7 cry15Aa 与 cry51Aa2基因的 PCR 检测

根据1.2.1的测定结果选择对绿盲蝽具有杀虫活性的Bt菌株，参照Shu等的方法［20］提取其基因组DNA，以 Bt菌株基因组DNA为模板，利用所设计的cry51Aa2引 物（F: 5’-TTGGCAATTTTAGATTTAAAATC -3’；R: 5’-TTAATTTGTTTTTATTGGACTTGTTGG-3’）和Primer star高保真DNA聚合酶进行PCR扩增。 反应条件为：95℃预变性4 min；94℃变性30s，50℃退火30 s,72℃延伸2 min, 30个循环。对绿盲蝽具有杀虫活性菌株中的cry51Aa2基因进行PCR检测。cry15Aa基因检测引物与PCR条件参考文献［13］进行。

2. 结果与分析

2.1 Cryl5Aa蛋白的提取与纯化

利用实验室克隆的rcy15Aa基因进行IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE分析发现（如图1所示），当IPTG浓度为1.0 mmol/L，诱导温度为30℃时，Cryl5Aa蛋白获得了较高的表达量，并且在可溶组分与非可溶组分中均有约50ku条带表达（泳道3和6）。

进一步将离心收集的Cry15Aa蛋白的可溶组分进行镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE电泳结果显示，最终洗脱下分子量约为50ku的Cry15Aa蛋白 （图2）。理论上rry15Aa基因的表达应获得分子量约为35ku的蛋白，分析这可能与蛋白在大肠杆菌表达体系中折叠异常有关。

图1不同温度下Cryl5Aa蛋白表达的SDS-PAGE分析结果

图2 Cry15Aa蛋白镍柱亲和层析纯化的SDS-PAGE分析

2.2 Cry15Aa蛋白对绿盲蝽的生物活性测定结果

经凝胶过滤纯化的Cryl5Aa蛋白进行定量分析后，终浓度为0.12mg/mL，对绿盲蝽进行生物活性测定，初步生测结果显示：以20mmol/L Na2C03/NaHC03(pH 10.0)缓冲液为空白对照(死亡率为23.3%)，绿盲蝽的死亡率为46.7%，校正死亡率为30.5%。说明Cryl5Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的活性。

2.3 Bt菌株杀虫蛋白的制备与对绿盲蝽的生物活性

将实验室分离的360株Bt菌株培养至芽胞晶体释放，提取蛋白，将提取的Bt蛋白进行酶解纯化，然后对绿盲蝽进行生物活性测定，进行活性筛选。根据绿盲蝽Bt蛋白生物活性测定的试验结果，计算校正死亡率，最终筛选出校正死亡率大于40%的Bt菌株20株(表2)。

2.4对绿盲蝽具有杀虫活性Bt菌株的蛋白鉴定

利用Cry15Aa与cry51 Aa2基因的引物对20株Bt菌株进行PCR检测，发现20株Bt菌株中并不含有已经报道的对盲蝽具有杀虫活性的Cry15Aa与cry51Aa2基因。

对所提取的20株Bt菌株蛋白酶解消化，进行 SDS-PAGE分析，结果发现，13株菌株C8-E3.C8-D6、C8 - B7 、 C8 - B6、B15 -A5、 C9 - E4、B16 - D2、 C12-C4、C7-A10、C7-A9、P13-F5、B15-E1 和 C9 - F2获得了 60 ku 的片段；菌株 C12-F2.P13-F2.C12-F7、P13-E2、P12-C3、C7-E5和P13-D2菌株只有小条带，而且饼不突出（图3）。对切取的部分条带进行LC-MS/MS质谱分析，途中黑色方框（1-26）即为选取质谱鉴定的条带。20株菌株中共有11株经质谱分析获得结果，利用Mascot在Bt杀虫蛋白库中进行本地数据库检索，结果发现，仅8株菌株（B15-A5、C9-E4、C7-A9、P13-F5、B15-E1、P13-E2、C9-F2、P12-C3）中可能含有Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、 Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、CrylBa、CrylBe 和 Cry8Ha 等蛋白的片段（表3）。除此之外，菌株P13-F5、P13-Ej.C-Fj和P12-C3中还检测到了 Cry15Aa蛋白的片段，虽然Cry15Aa蛋白序列覆盖度较低。

图３ 胰蛋白酶消化后的Bt蛋白的SDS-PAGE分析

3. 讨论

转基因抗虫棉的广泛种植，有效地控制了棉花害虫的危害，减少了农药的使用，带来了巨大的经济效益与生态效益。因此，筛选对棉花害虫高效的Bt杀虫基因具有重要的意义。然而，自1997年我 国开始商业化种植转Bt基因棉以来，棉田化学农药使用量因此而大幅度减少，减弱了对盲蝽等转基因棉花非耙标害虫的控制，使之成为棉花的主要害虫，因此，针对棉盲蝽等刺吸式口器害虫筛选有 效的Bt菌株及杀虫基因是目前一项紧迫的研究 工作。

盲蝽成虫以口针刺吸棉株嫩叶、幼芽、幼嫩花蕾的汁液为害，因此，Bt胞晶混合物难以直接用于杀虫活性测定。本研究针对绿盲蝽刺吸取食这一特点，利用中国农业科学院植物保护研究所棉花害虫组建立的人工饲料测定方法，进行了Bt纯化蛋白的杀虫活性评估，尽管对照害虫存在较高的死亡率，但是与对照组相比，360株Bt菌株中，有20株菌株表现出显著的杀虫效果。上述结果说明，虽然人工饲料测定方法仍需进一步改进，但是已经可以用于盲蝽有效Bt菌株与基因的初步评估，对当前相关研究工作有重要的促进作用。

近年来研究发现Cry51Aa是一类对盲蝽具有活性的Bt杀虫蛋白，Cry51Aa属于Mtx类杀虫蛋白，结构上与目前广泛应用的Cry1A类杀虫蛋白不同。因此，本研究利用实验室此前克隆的Mtx类杀虫蛋白基因cry15Aa对绿盲蝽进行杀虫活性研究，结果显示Cry15Aa蛋白对绿盲蝽具有一定的杀虫活性。Cry15Aa于1992年首次在苏云金芽胞杆菌HD542中被发现，可以形成菱形晶体，在 HD542中表达的Cry15Aa蛋白大小约35 kDa， 对鳞翅目害虫苹果蠹蛾(Cydia pomonella)、烟草天蛾(Manduca sexta )和菜青虫(Pieris rapae )都有一定的杀虫活性，本研究发现，其与另外一个Mtx 蛋白Cry51Aa相似，对半翅目害虫盲蝽也有一定的杀虫活性。

为了对盲蝽有效的Bt菌株中可能含有的杀虫蛋白进行鉴定，对上述菌株进行了LC-MS/MS质谱分析，在 B15-A5、C9-E4、C7-A9、P13-F5、B15-E1、P13-E2、C9-F2和P12-C3等菌株中检测到Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ae、Cry1Af、Cry1Ag、Cry1Ah、CrylBa、CrylBe、Cry8Ha等对鳞翅目、鞘翅目害虫有效的Bt杀虫蛋白的片段；在P13 -F5、P13-E2、C9-F2和 P12-C3中检测到了Mtx类蛋白Cry15Aa的片段，说明这些菌株中可能含有 Cry15Aa类似的蛋白。进一步PCR鉴定结果表明，上述菌株中并不含有已知的cry15Aa与cry51Aa 基因，显示这4株菌株中可能含有Cry15类的新基因。上述研究结果表，本研究筛选获得的20株Bt菌株中可能含有对绿盲蝽具有杀虫活性的新基因。

总之，本研究针对日益严重的棉花害虫盲蝽开展Bt菌株筛选与鉴定研究，筛选获得了对绿盲蝽具有一定杀虫活性的基因1个，对绿盲蝽有效的Bt菌株20株，这些研究结果对绿盲蝽的防治具有重要的意义。

文章转自《植物保护》杂志，作者张学雯、束长龙、陆宴辉、刘春颖、张杰、高继国

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