荧光定量PCR，你了解多少?

1荧光定量PCR技术原理与应用?

问＆答-------------------------------------------

技术原理：

实时荧光定量PCR，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数方式增加的，随着反应循环数的增加，最终PCR反应不再以指数方式生成模板，从而进入平台期。将已知浓度的标准品梯度稀释进行Real Time PCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。

Real Time PCR的定量原理图

应用进展：

Real Time PCR是具有划时代意义的技术，具有操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等优点，不仅应用于基因表达解析，还广泛应用于SNP分型解析、物种鉴定、病毒和病原菌的检测、转基因食品的定量分析、导入基因拷贝数的解析等诸多领域。 

阈值（threshold）： 在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。 

Ct值（Cycle threshold）： 表示每个PCR反应管内荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 

经数学理论证明，Ct值与起始模板数的对数值成反比线性关系。

阈值和Ct值的相互关系图

决定系数（r Squared）：反映标准曲线的直线性，理想值应大于0.98，越接近于1说明直线性越好，定量越准确。

斜率（slope）：反映PCR扩增效率，-0.25～-0.33（根据不同装置数值不同）。

扩增效率（E）：理想扩增效率应在0.8﹤E﹤1.2。

标准曲线的评价指标图例

2荧光定量检测方法如何选择?

问＆答-------------------------------------------

必须根据具体的实验用途进行选择。如果用于区别同源性高的序列以及进行SNP分型解析等多重PCR检测，荧光探针法无可替代，而进行除此之外的Real Time PCR实验，我们推荐使用简单易行、成本低的SYBR Green I荧光嵌合法。可以参考如下信息：

3探针法进行荧光定量，探针如何选择?

问＆答-------------------------------------------

探针法通常是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等），3’端带有淬灭物质（如：TAMRA、Eclipse、BHQ等）的探针进行荧光检测的方法。当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能检出荧光。探针的报告基团的发射波长要在淬灭基团的吸收波长范围内。

4Real Time RT-PCR如何选择Two Step RT-PCR和One Step RT-PCR?

问＆答-------------------------------------------

基因表达解析等绝大部分RT-PCR，非常适合选择Two Step RT-PCR，而RNA病毒检测等以基因检测为目的RT-PCR，应优先考虑防止污染，所以建议选择One Step RT-PCR。 

1. 进行Two Step RT-PCR反应时，可选择Random Primer、Oligo dT Primer或基因的特异性引物进行反转录反应，然后再将一部分反转录反应液（cDNA）作为模板添加到Real Time PCR反应液中。使用反转录引物时可以根据实验目的选择合适的反转录引物，如果选择Random Primer或Oligo dT Primer，合成的cDNA可用于复数种类基因的检测，cDNA溶液可以稳定地长期保存，供以后解析使用。 

2. One Step RT-PCR的反转录反应和PCR反应在同一反应管内连续进行，操作简单，污染几率低。但此时的反转录反应和PCR反应都并非为各自的适宜条件，所以One Step RT-PCR通常比Two Step RT-PCR反应效率低。此外，与Two Step RT-PCR反应相比，反转录酶等的使用量多，每个反应的成本相对较高。One Step RT-PCR反应的反转录反应引物只能使用基因的特异性PCR下游引物，而不能使用Random Primer或Oligo dT Primer共用引物。

5绝对定量与相对定量有哪些差别?

问＆答-------------------------------------------

绝对定量与相对定量有如下差别：

1. 绝对定量：是对未知样品的绝对量（拷贝数）进行测定的方法；通常应用于病毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。 

2. 相对定量：是分别测定目的基因和参比基因的量，再求出对于参比基因的目的基因的相对量，最后再进行样品间相对量的比较。主要用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片、siRNA干扰的实验结果。

6 荧光定量实验的成功因素有哪些?

问＆答-------------------------------------------

荧光定量实验的成功因素如下：

1. 优良试剂的选择。

Real Time PCR试剂的选择是否合适，也是实验成功的关键点，所以在这里有必要对试剂的选择要点加以说明。 

a. 标准曲线的质量直接影响定量的准确性。建议使用标准品专用稀释Buffer稀释标准品。 

b. 根据采用的荧光检测方法进行试剂选择。选择探针法专用试剂或SYBR Green I法专用试剂。 

c. Real Time RT-PCR要根据实验目的进行试剂选择。mRNA表达量分析选择Two Step RT-PCR试剂，病毒病原菌检测选择One Step RT-PCR试剂。 

d. Real Time PCR 反应通常样品数量较多，操作步骤过多易产生错误。最好选择PCR反应用Buffer、DNA聚合酶、dNTP等试剂已经预混在一起的2×Premix Type试剂，操作更加简单方便。同时，使用的试剂最好不需要进行Mg2＋浓度的优化等实验。 

e. Real Time PCR反应对反应特异性要求高。最好选择应用Hot Start DNA聚合酶的试剂。但有一点需要强调，Hot Start DNA聚合酶有两种类型，即化学修饰型和抗体结合型。使用这两种Hot Start DNA聚合酶的PCR反应条件不同，使用化学修饰型Hot Start DNA聚合酶，需要在PCR条件的最初步骤设置10～15分钟的热变性程序，以恢复DNA聚合酶的活性；而抗体结合型Hot Start DNA聚合酶，不需要长时间的热变性步骤，通常的PCR条件即可恢复DNA聚合酶的活性，最适合快速PCR反应。 

f. 所选试剂要与使用的Real Time PCR检测系统相匹配。最好选择对各种机型装置都显示良好反应性能的试剂。 

2. 引物和探针的设计。

引物设计原则：    

探针设计原则： 

3. 反应条件的优化

依据所使用的产品说明书进行反应条件的优化。

4. 实验操作

必须分区操作。通常分为：反应液调制区；模板添加/样品制备区；PCR反应区。