单克隆抗体表征分析的最新技术进展：非变性毛细管区带电泳质谱联用法（CZE-ESI-MS）

2021-04-21 15:11:08, 安捷伦科技安捷伦科技（中国）有限公司

在全球生物制药市场与研发中，单克隆抗体药物是非常重要的品类之一，是近年来增长率极大的一类蛋白类药物。单克隆抗体药物具备特异性高、靶向性强和毒副作用低等特点，是目前治疗肿瘤和免疫相关疾病的研究热点，受到了诸多药企的追捧。自 1985 年首个单克隆抗体药物上市后，目前已有 80 多个单抗类药物被 FDA 批准上市。

单克隆抗体表征技术现状

单克隆抗体存在不同的翻译后修饰（糖基化、氧化、脱酰胺化）和结构变化（二硫键错配、多聚体等），这些变化会引起单克隆抗体药物活性、稳定性和免疫原性的变化。因此，必须在研发和生产过程中对这些关键质量属性进行监控，保证单克隆抗体药物的安全性和有效性。

除了反相、体积排阻和离子交换外，毛细管电泳，特别是毛细管区带电泳（CZE）和毛细管等电聚焦（CIEF）两种分离模式，被广泛用于单克隆抗体的质量研究中。特别是近几年来，随着接口技术的发展，CZE-ESI -MS 和 CIEF-ESI-MS 技术越来越多的被用于蛋白表征及电荷异质性的研究中。

好文分享：

采用安捷伦/永道致远 CZE-ESI -MS 联用技术对单克隆抗体进行表征分析

本期我们特别分享来自 Xiaojing Shen 等最新发表在 International Journal of Mass Spectrometry 上的一篇关于蛋白表征的的文章，该文章采用安捷伦/永道致远的基于电渗流驱动的鞘流液接口的 CZE-ESI-QTOF 系统，成功建立了非变性条件下蛋白表征的新方法。

在文章中，作者不仅优化了质谱参数和 CZE 的分离条件，而且还创新性的使用毛细管等电聚焦（CIEF）的进样方式，增大了 CZE 的进样量至 200nL，显著提高了检测的灵敏度。

实验条件

所用样品：SigmamAb 和 NISTmAb
所用毛细管：LCP 和 LPA 涂层的毛细管，内径为 50μm
所用仪器：Agilent 7100 毛细管电泳（CE）系统，高分辨质谱 Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF；毛细管电泳和质谱的接口：基于电渗流的钠升 E-MASS II 离子源（永道致远）

7100 CE + E-MASS II + Advancebio 6545XT LC/Q-TOF

E-MASS II 离子源接口的原理及示意图（永道致远）

质谱参数的优化：

为了提高大分子检测的灵敏度和非变性的质谱检测，本方法优化了fragmentor、skimmer和collision voltage等参数，结果表明 fragmentor、skimmer 和 collision voltage 的最佳值分别为 380、300 和 0 时，所得结果最好。

不同 skimmer（A）和collision voltage（B）下质谱的响应

CZE 分离条件的优化：

背景电解质溶液和鞘流液的优化，尝试了 10mM 的甲酸铵和乙酸胺，结果显示，在乙酸铵条件下蛋白带的电荷数目小于甲酸铵的条件（两种条件下迁移时间接近），表明乙酸铵可以更好的维持蛋白的非变性结构；又尝试了不同浓度的（10、25 和 50mM）乙酸铵条件，结合灵敏度和维持蛋白的非变性状态，最终选择 10mM 的乙酸铵为鞘流液，25mM 的乙酸铵为背景电解质溶液。

D 图：10mM 乙酸铵（蓝色）和10mM甲酸铵条下的质谱图；E 图：10mM （蓝色）和 50mM（红色）乙酸铵的质谱图

进样方式的改进：

毛细管分离的进样体积很小，这在一定程度度上会影响 CZE-MS 联用的灵敏度，虽然已经有报道可通过 pH 值叠加的方式来提高进样量，但这些方法都不适合在非变性条件下的质谱检测。

本方法建立了一种基于 CIEF 原理的进样方式，不仅可以增加进样量至 200nL，还可以分离得到带不同电荷的蛋白异构体：

SigmamAb 基于 CIEF 的进样方式如下：先进样 50mM 乙酸铵溶液（pH=9），再进样品（含有两性电解质的 10mM 的乙酸铵溶液），在进样 25mM 的乙酸铵电解质溶液（pH=6.8）。进样完毕后，加高压后蛋白在毛细管内进行聚焦后，再使用 CZE 模式下进行分离检测。

SigmamAb 蛋白在 CIEF 进样模式下的 CZE-MS 的 4 个峰的离子流图及及每个峰对应的质谱图

使用相同的 CIEF 进样原理，得到 NISTmAb 的 CZE 分离结果如下：

A 图 NistmAb 的 cIEF 进样模式下的 CZE-MS 离子流图；B 图 Peak2 的质谱图；C 图和 D 图分别为质谱的放大图

Peak2 的质谱图的去卷积结果（单体和二聚体）

Peak1 和 Peak3 的去卷积结果

总结：

本方法使用毛细管质谱联用技术（7100 CE +Advancbio 6545XT LC/Q-TOF+ 永道致远的 E-MASS II 离子源接口，建立了单克隆抗体的 CZE-ESI-MS 非变性分离的质谱表征方法；使用基于cIEF的进样方式，将进样体积增大至 200nL，提高了检测灵敏度。此方法为蛋白药物的非变性质谱检测提供了新的思路。

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除了 CZE-ESI-MS 可以用于蛋白表征研究外，7100 CE +Advancbio 6545XT LC/Q-TOF+ 永道致远的 E-MASS II 离子源接口还可用于蛋白药物的电荷异质性研究。

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