做表型分析实验的你，了解 Cell Painting 分析法吗？

Cell Painting 的目的是尽可能多地观察分析细胞，以构建表明细胞状态的代表性图像。用于 Cell Painting 的标准染料组可以标记细胞核、内质网、肌动蛋白、高尔基体、RNA（和核仁）以及线粒体。高内涵细胞成像系统配备有合适的滤片组，用于快速获取荧光标记的细胞图像。然后进行自动图像分析，以识别、提取和测量特定的细胞特征。这些包含表型谱的大量的参数能够被进一步分析并用于针对性选择或聚类分析（Figure 1）。

这里，我们展示一个基于 Gustafsdottir et al ^[8] Cell Painting 的高内涵表型分析工作流程。该工作流程使用 IN Carta^™ 图像分析软件和 HC StratoMiner^™ 数据分析，使整个分析易于且具有不牺牲质量的图像分割和测量工具。

在 IN Carta 软件中，图像分析程序可根据不同的成像情况进行参数调整，以实现对细胞和细胞器的准确检测。其中深度学习分割模块（SINAP）可以用来提高对具有挑战性特征的检测的分析准确性。该模块可用于检测细胞核或其他的细胞参数。另外，用户可以使用自己某类实验的数据集来训练深度学习分割模块（SINAP），使其成为分析此类实验的专业分析模块。HC StratoMineR 是一个基于网络的平台工具，用于处理大型多维数据集。该平台具有引导式的工作流程用于分析高内涵的数据分析。

正因为 HC StratoMiner 是通过浏览器访问的网络工具，因此用户不需要占用额外的计算机资源就可以处理大型数据集。使用这个工作流程，同样的化合物处理的细胞分析出的表型特征是相似的。例如，层次聚类分析将紫杉醇和鱼藤酮等剧毒化合物分组。同一分类中，氯喹和汉防己甲素都影响自噬 ^[7，9]。这些结果证明，这个工作流程是一个用户友好和准确强大的用于高内容表型分析的方法。

根据制造商提供的方法，对 U2OS 细胞系（ATCC）进行传代和培养。根据 Bray et al ^[6] 提供的方案来实施 Cell Painting。简单地说，将 U2OS 细胞接种在 Greiner 384 孔µ 透明板中，每孔 2000 个细胞，共 40µL McCoy 培养基（补充 10% FBS）。药物处理前，细胞在 37℃ 培养 24 小时。

在细胞铺板后 24 小时并在添加化合物之前，使用 2% FBS（体积/体积）含量的 McCoy 培养液替换之前的细胞培养基。以下列举 11 种需要用到的化合物：Ca-074-Me，CCCP，chloroquine（Enzo）， cytochalasin D, etoposide（Calbiochem）， latrunculin B, rapamycin（Sigma），rotenone （Enzo），staurosporine，paclitaxel，and tetrandrine（除非另有说明，所有化合物均购自 SeleckChem）。

化合物分别按照 1:3 的梯度稀释设置 7 个不同的浓度处理细胞，每个化合物浓度处理的样本设置 4 个检测复孔。在同一块检测板中同时设置 DMSO 对照组，阴性对照组和阳性对照组。化合物处理的细胞孵育时间为 24 小时。

活细胞使用 MitoTracker DeepRed（终浓度500nM） 在暗室中 37℃ 孵育 30min，然后使用 PFA（3.2% vol/vol）细胞固定反应 20min。在室温下使用 triton-100（0.1%）孵育细胞 20min。染色液配置成以下的浓度：5 µL/mL phalloidin, 100 µg/mL concanavalin A, 5 µg/mL Hoechst, 1.5 µg/mL WGA and 3 µM SYTO 14 dye ，溶于封闭液体系（1X HBSS and 1% wt/vol BSA）。在室温下，洗涤细胞并加入染色液孵育 30min。染色完毕后，移除染色液并洗涤细胞 3 次，然后用锡箔纸包裹避光保存。所有的细胞洗涤步骤均使用 1X HBSS 溶液.

使用 ImageXpress^® Micro Confocal 高内涵成像系统（Molecular Devices）进行细胞成像。成像使用 20X Plan Apo 物镜，共聚焦针孔尺寸 60 µm；所有荧光通道的激发和发射波段信息为（ex/em）：DAPI 377/447, FITC 475/536, TRITC 543/593, TexasRed 560/624, Cy5 631/692。每孔设置 4 个成像视野。利用最佳聚焦投影方式获得了一个由三幅图像组成的小 Z 轴叠层图像，以解决可能影响图像聚焦的板形问题。

利用 IN Carta 软件进行图像分析。图像分割方法如下：以 Hoechst 染色细胞核为主要目标，采用自定义分割算法对图像中染色目标进行分割（预染为细胞核的模型），接触图像边缘的目标被排除在计算中。TRITC 通道使用 Robust 选项对细胞进行分割。三个额外的细胞器分类方法使用指定选项：Mitochondria (networks), actin（fibers）and endoplasmic reticulum（networks）。每个细胞总共可以选择 280 个测量值作为数据输出。

在特征提取完毕后，单个细胞水平的数据被导出成 CSV 格式的文件并和包含有化合物信息的高内涵数据的 text 文件一起上传到 HC StratomineR（CoreLife Analytics）。孔板预览导航图是使用 StratoMineR 界面来定义的。使用质量控制工具，将状态异常的孔从分析中去除（被移除的异常孔少于 50 个）。软件通过特征缩放的建议进行数据转换。主要成分分析（PCA）用于数据整理。由于产生的 15 个成分用以评估模型的距离评价，是用来衡量不同处理下细胞的表型效应程度 ^[11]。模型的距离评价可用于针对性选择或聚类分析。

实验共使用 11 种化合物处理细胞，其中一些已经在先前的 Cell Painting 研究中用作参考化合物 ^[10]。化合物孵育处理后，对细胞中相应细胞器进行染色，包括线粒体、肌动蛋白、高尔基体、核仁（RNA颗粒）、内质网（ER）和细胞核（Figure 2）。

这些模型能够通过图像进一步训练软件来自主识别用户感兴趣的目标。

深度学习分割模块（SINAP）加入分析流程用于改善细胞核的识别（Figure 3）。

内置的细胞核分析方法是在超过 1000 多张细胞核图像的识别中建立起来的自主识别方法。训练集包括使用不同放大倍数的成像模式（荧光和明场）获得的细胞核，并用不同的染料（DAPI，Hoechst，苏木精/曙红）染色，因此使其适用于各种各样的图像。在这种方法的自学习建立过程中，图像集包含了明场和荧光成像模式下不同放大倍率和各种染色（DAPI, Hoechst, Hematoxylin/Eosin）的情况，因此该方法能够适用于各种各样的图像分析。

在图像分析设置期间，我们能够给观察到该核模型分析方法提供了改进的细胞核检测并且能够准确地分割相接触的细胞核。SYTO14 染色标识细胞质的样本使用 Robust 选项的细胞分割方法来进行分析。实验同时还对内质网，线粒体和肌动蛋白进行了识别和分析。另外，实验还从整个细胞，细胞核和细胞质的所有通道进行总体强度的测量。

对特征的分析能够容易的在 IN Carta 软件中进行预览。热图显示和直方图等选项可用于一般数据探索。单个细胞的各项分析数据或整个样本孔的整体数据 C 均可以以 CSV 格式的文件导出，并可用于进一步的数据挖掘和分析（Figure 4）。

从 IN Carta 软件获取的测量参数能够被导出并上传到 HC StratoMiner 软件中进行进一步的数据分析。这里，我们使用 HC StratoMiner 软件可以引导平台允许非数据专家很容易的浏览整个数据分析工作流程。另外，HC StratoMiner 是通过浏览器访问的网络工具，因此终端用户不需要占用额外的计算机资源就可以处理大型的复杂的数据集。

主要成分分析方法（广义加权最小二乘法）用来将 280 个测量值减少到 15 个相关分量。然后进行层次聚类法，并在树状图中表示每个孔之间的关系（Figure 5）。

用相同化合物处理的细胞倾向于聚类在一起。例如，簇 9 仅由星形孢菌素处理的细胞组成。已知具有相似细胞效应的化合物也聚集在一起，如细胞松弛素 D 和 latrunculin B，两种肌动蛋白聚合抑制剂均在簇6中发现。已知影响自噬途径的粉防己碱和氯喹也聚集在一起（簇 5）。这些结果表明，所提出的工作流程是执行高内涵表型分析的一种可行且易于实现的方法。

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