人体干细胞诱导神经元细胞系的 3D 模型表征分析

2021-01-23 01:24:40, 美谷分子仪器美谷分子仪器（上海）有限公司

简介

开发更复杂的、生物相关的和预测的基于细胞的化合物筛选方法是药物发现中的一个主要挑战。三维 (3D) 分析模型的开发和集成正变得越来越流行，并驱动着生物转化学的发展。具体而言，3D 培养物具有精致浓缩了人体组织各方面特征的优点，包括结构、细胞组织、细胞-细胞和细胞-基质相互作用，以及更多生理相关的特征延伸。

水凝胶广泛用于模拟在 3D 环境中生长的神经细胞的细胞外基质。水凝胶是聚（乙二醇）(PEG) 为基础，完全合成的，全透明的物质。水凝胶通过掺入 MMP 切割位点来帮助细胞迁移，并包含 RGD 细胞粘连基序以支撑细胞的粘附作用。完全合成的水凝胶是预先铺展在 96 孔板中，其特征在于深层次的密度梯度促进细胞在水凝胶表面上进行三维渗透 ( 3D ProSeed^TM 水凝胶，ECICA 技术 )。这种水凝胶预制板使用方法简便，同时能很好的兼容自动化设备 ( 图 1 )。

图 1 图解 3D ProSeed^TMsurface 工作原理以及在模具中培养神经元细胞的过程

同时，人类诱导的多能干细胞 (iPSC) 衍生的神经元也越来越多地用于生理细胞模型的开发;与用于神经科学应用的原代细胞和动物模型相比，它们的人类起源，更长久的再生能力和无限量的可用性使它们在神经系统科学应用中独具优势。

优势

• 开发用于化合物筛选的 3D 神经毒性测定；

• 利用水凝胶和高通量成像进行高通量的 3D 神经突触长度测定；

• 进行定量测量，可用于定义 IC₅₀ 值并比较各种化合物的毒性。

在多孔板中形成 3D 神经元网络

我们优化了 96 孔板的细胞培养和染色，并发展了完善的共聚焦成像及分析方法，让神经元以 3D 模型的形式进行形态表型和生存能力的测量。

用于测定的细胞是 CN.4U^TM(Axiogen AG)，是由神经元(谷氨酸能、多巴胺能和GABAergic )和星形胶质细胞组成的人 iPSC 诱导细胞混合体。CNS.4U^TM细胞在 3D ProSeed^TM 水凝胶 (Ectica Technologies) 中孵育 14 天。细胞以 40000 个神经元每孔的密度培养在 200 μl 培养基中。对于选定的研究，也评估了细胞接种密度的影响 ( 5000 ～ 8000 个细胞/孔 )。培养基的组成包括 50:50 混合神经基础培养基 + DMEM / F12 + 补充剂 (Axiogenesis)。

细胞接种在水凝胶的表面，然后渗透到水凝胶内部（图 1）。神经突起生长开始于种植后 24h，接着连续培养 14 天以上。通过透射光成像监测神经网络的形成过程。对于端点测量，使用 4% 甲醛固定细胞，然后用 0.1% 的 Triton X-100 通透，并用荧光抗体结合抗体对 TUJ-1 神经元标记物染色，加上 Hoechst 核染色。

通过图像堆叠生成 3D 立体图像

高含量成像分析可用于评估治疗对神经网络形成的影响。沿着轴向 ( Z-堆叠 ) 在不同平面处获得一系列图像（图2）。使用配有 10x 或 4x 物镜的 ImageXpress^® MicroConfocal 高内涵成像系统进行图像自动拍摄。成像步径 5 - 10 μm 的 11-33 个平面的 Z-堆叠，覆盖深度可达 150-300 μm。除了自动保存 2D 投影（仪器荧光通道支持的最大投影或最佳聚焦）图像外，还保存了所有单个图像并用于 3D 分析。

图 2 CNS.4UTM 细胞以 4000 细胞/孔的密度培养在 3DProSeedTM 水凝胶中，第 14 天时进行共聚焦成像。看出神经突触向水凝胶中延伸了数百微米。核用 Hoechst ( 红色 ) 标记，微管用 TuJ-1 ( 绿色 ) 标记。四张图像分别代表不同的深度，可以看出神经突触向水凝胶中延伸了数百微米。

通过一系列 2D/3D 图像获取测定值

使用集成式 Meta Xpress 软件中提供的 3D 分析模块进行图像分析。有两种方法可以进行定量分析：投影图像（2D）分析或 3D 分析。使用神经突触生长算法分析 2D 获得仪器荧光通道支持的最大投影图像( Hoechst 染色和 TuJ-1 荧光 )。表型读数包括通过多重读数定量表征神经网络的长度和复杂性，包括测量神经突向外生长，过程和分支的数量，以及细胞数量和活力。获得仪器荧光通道支持的最佳焦面投影图像用于分析透射光图像。投影图像的分析能够快速准确地定量这些表型。图 3 显示了使用透射光荧光（TuJ-1 和核染色）的神经网络的图像示例，以及用于测量神经突向外生长的分析建模。

图 3 2D 投影图像进行分析。（顶图）神经元的透射光投影图像，以及进行分析的建模叠加图层。CNS.4UTM 细胞以不同的接种密度 ( 5,000-80,000 个细胞/凝胶 ) 接种在 3D ProSeed^TM上。将细胞培养 14 天，然后在 ImageXpress Micro Confocal 系统上进行染色成像。进行 3D 成像 ( Z-堆叠 ) 并使用 2D 投影图像进行分析：获得仪器荧光通道支持的最大投影图像和最佳焦面图像。分析自动测量的细胞数，神经突向外生长 ( 神经突触的长度 )，以及过程和分支的数量。图表显示了各种测量值对神经元数量的依赖性。显示三个孔板的平均值。MetaXpress 3D 分析模块将不同平面的对象组合在一起，以创建细胞和网络的三维可视化。3D 可视化图层代表了单个细胞核（假彩色）和 TuJ-1 阳性神经突和细胞体（绿色） ( 图 4 )。MetaXpress 自定义模块编辑器可以自定义向外生长的神经突触和细胞核。首先在每个平面中找到对象，然后使用“通过最佳匹配连接”功能在 3D 空间中连接。3D 分析在整个基质体积内提供更精确的细胞定量，包括有重叠的物体。

3D 水凝胶可用于化合物筛选

表型读数包括通过多路读数定量表征神经网络的范围和复杂性。我们评估了测定重现性，表征了多次测量，并测试了一系列已知神经毒剂的化合物。比较了两种分析方法：使用标准神经突生长算法分析投影图像，使用定义神经突，分支和核的定制模块进行 3D 分析。

图 4：MetaXress 软件对水凝胶中细胞和网络的三维评价。( 左上 ) 3D 可视化显示细胞核（伪色）和 TUJ-1 阳性突起和细胞体（绿色）。（右上）单个平面中定义出来的神经生长的建模图层。进行 3D 分析，确定每个孔的神经突起的数量、神经突的总体积、分支点的数目和细胞（细胞核）的数目。图表说明了测量数据对神经元数量的依赖性（三联）。

我们通过在接种后 72 小时用化合物处理以这种形式生长的细胞来评估水凝胶中神经毒性研究的可行性，测量处理后 7-10 天的效果。( 图 5 )。每 2 天更换含有化合物的培养基。处理后，将这些培养物固定，染色，并如上述方法进行成像。然后，我们测量了所选化合物对神经网络（神经突向外生长和其他读数）的浓度 - 反应效应。这些实验提供了使用测定系统进行神经毒性评估的概念证据。

图 5 测量化合物的剂量反应。在接种后 72 小时，将具有已知神经毒性作用的三种化合物以 0 至 10 μM 的不同浓度添加至神经元培养物中。( 上 ) 化合物对神经突发育的抑制作用显而易见。( 上图 ) 2D 扁平图像 ( 仪器荧光通道支持的最大投影 ) 用于分析。显示神经突向外生长的浓度 - 响应曲线：甲基汞 (IC₅₀ 5 nM)，狄氏剂 (IC₅₀ 170 nM) 和鱼藤酮 (IC₅₀ 220 nM)。IC₅₀ 值与 3D 分析和先前公布的 data 4 相当。（下图）3D 分析结果。测量神经突的总体积。显示总分支的浓度-响应曲线：甲基汞（红色，IC₅₀ 2 nM），狄氏剂（蓝色，IC₅₀ 170 nM）和鱼藤酮 ( 绿色，IC₅₀ 750nM )。

总结

我们开发了一种定量高通量检测方法，可以评估 3D 神经元培养物的活力和形态变化。使用 3D ProSeed^TM 水凝胶，CNS.4U^TM 人源 iPSC 衍生的神经细胞和共聚焦高内涵成像，该方法可用于高通量化合物毒性筛选和安全性评估。高分辨率成像和多参数分析可进行神经突和单细胞计数，并统计表征神经突发育和 3D 分支。使用 2D 和 3D 分析提供定量测量，可用于计算 IC₅₀ 值和比较各种化合物的毒性。

参考文献

1. Ehrbar, M.; Rizzi, S. C.; Hlushchuk, R.et al., Biomaterials 2007, 28 (26), 3856-66.

2. Simona B.R. et al., Biomater. Sci.,3:586-591, 2015.

3. Zhang N. & Milleret V., SLAS Discovery,accepted, 2017.

4. Sirenko et al., Assay and Drug Dev Technologies12 (9-10):536-47