2020-12-23 04:56:24, Biotage 拜泰齐贸易(上海)有限公司
反相快速纯化色谱以较低的成本和对环境的影响,实现了样品的高效分离纯化,影响了整个化学工业。反相Flash色谱在最近的十几年时间里形成了巨大的应用飞跃,但是,由于缺乏信息和数据的支持,化学家在很多情况下,都是靠经验进行纯化工作。
极性化合物、水溶性化合物得到了很多药物和天然产物研发机构的重视,这些分子是组成生物体的重要化合物。传统方法是用HPLC(高效液相色谱法)纯化制备此类化合物,但是成本较高。对于每天都要进行大量纯化工作的化学家来说,使用预装的反相快速纯化色谱柱是一种非常好的选择,可以处理各类极性化合物。
反相快速制备色谱不同于正相色谱,主要表现在三方面:
1) 固定相
2) 流动相
3) 适用的样品类型
固定相
正相硅胶具有极性基的表面;而反相硅胶是经过改性,表面键合烷基链(例如 C-18),它的极性更小,因此,它对极性化合物有较小的保留。
经典的反相硅胶表面的图示。C-18的烷基链键合在硅胶表面,增加了硅胶的疏水性。
然而,由于长时间正相硅胶的强大的极性作用,经常会和样品形成死吸附,影响分离效果,科学家在硅胶是基础上进行了修饰,将C碳链连接到硅胶的羟基上使其极性降低,具有了脂溶性的特质,同时由于固定相基质的变化,之前在正相当中所使用的的溶剂变得不可用,需要使用水相和有机相混合体系进行洗脱,由于各类化合物在水相和有机相之间都有相应的分配系数,样品的分配系数不同,洗脱下来的速度就会形成差异,最终达到分离的目的。
目前市面上的反相Flash 固定相填料主要为C18,也有少部分的C4,C8等,如Bioatge 推出的专门针对于多肽大分子分离的多肽分子纯化色谱柱。
流动相
正相色谱,因为硅胶表面的硅羟基极性大,极性大的水溶性化合物很难被洗脱下来,只有使用更强极性的溶剂才能成功。因此在正相体系中,所使用的流动相都是极性比硅胶更大的溶剂,通过更大极性的溶剂将样品系统下来,从色谱原理的角度,这种通过极性大小,分子将吸附的相互作用的分离方式,我们称之为正相洗脱分离方式。
正相色谱,因为硅胶表面的硅羟基极性大,极性大的水溶性化合物很难被洗脱下来,只有使用更强极性的溶剂才能成功。在正相色谱条件下,可供选择的溶剂很少,因此,对极性大的水溶性化合物,很难得到足够纯度的产品。
然而,在反相色谱中,因为,极性化合物和固定相的吸附性较小,因此用较小极性的溶剂,就可以实现比较理想的洗脱效果。所以,在实践中,反相色谱可以提供更好的分离方法。固定相变化之后,其流动相也需要随之改变,反相的流动相往往是通过水相和有机相两种溶剂的混合,例如:水和甲醇、水和乙腈等,通过在水和有机相之间的分配系数的不同从而达到分离的目的。
适用的样品类型:
由于反相条件下,修饰了硅胶表面的羟基,使其极性降低,使得其适用性变得更加宽广(相对比反相而言),各类极性的大小分子,天然产物,都可以在反相体系中得到有效分离。我们罗列了根据各类分子结构而可支持的不同色谱柱类型,可以发现反相的应用范围更宽广和多元化。
此外,上表中还有另外一种色谱柱类型:氨基色谱柱;这也是其中官能团化之后的色谱柱,其就是用氨基代替了传统的羟基,使整个色谱柱具有碱性,而非传统的酸性,此类类型的色谱柱适用于各种碱性化合物的分离,如各类生物碱等。代替各类需要加入三乙胺进行pH调节的正相分离体系,简化分离步骤,提高分离效率。
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