2020-12-13 03:23:04 帝肯(上海)实验器材有限公司
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支原体是直径0.2-0.8 µm的圆形或丝状微生物,属于柔膜菌目(Mollicutes),其缺乏典型的细胞壁结构[1],是目前已知最小可独立生存并进行自主复制的微生物(如图1)。
图1 支原体结构简图
目前,支原体有超过200多个物种,是哺乳动物细胞培养中的常见污染菌。有研究表明,5%-35%的细胞培养中均存在支原体污染,甚至有的可高达70%[2,3]。支原体污染可以对核酸、蛋白和细胞等产生深远而负面的影响,如改变核酸合成,影响细胞信号通路传导,改变细胞膜结构,影响细胞活力等[2]。细胞培养作为生物医学研究和生物制药(如抗体生产)的重要环节或生产原料,为确保其应用的准确性和良好质量状态,对细胞或其培养产物进行支原体检测是十分必要的,也是多国药典中所要求的检测项目。
目前检测支原体污染的方法包括分离培养法、PCR法、DNA染色法、酶法、ELISA方法等[4,5],其各有优缺点,如表1.
表1 支原体检测常见方法发简述
方法 | 灵敏度 | 优点 | 缺点 |
分离培养 (琼脂和肉汤法) | 高 | 简单、成本低、金标准 | 耗时(~28天),工作量繁琐、需要特殊分离培养基 |
DNA染色法(DAPI/Hoescht) | 低 | 简单、快速、成本低 | 假阳性高、结果变数大,难解释;无法区分菌株 |
ELISA | 中 | 快速,特异性好 | 成本高、抗体有限 |
酶法 (化学发光法) | 中 | 简单、快速,成本低 | 无法区分菌株 |
PRC法 | 高 | 简单、快速、特异性好 | 依赖特异性引物、假阳性、需要抽提核酸、操作相对复杂 |
由于没有一种方法可以同时兼顾速度、特异性和成本,所以通常研究者会根据实验需求,选择不同的组合对支原体进行检测和鉴定。而快速检测即为最初,也是最为重要的一个筛选步骤,根据快检的结果,研究者进而再使用其他特异性更好的方法进行鉴定或分离。目前速度最快的方法是酶法(化学发光法),检测时间<20分钟。基本原理为支原体特异性酶催化底物反应,将ADT转化为ATP,荧光素酶在有ATP存在的条件下,催化荧光素发出光,通过检测光信号来判断是否有支原体的污染,如下:
目前已经有商品化的试剂盒可以使用,如MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit(LONZA),TransDetect® Luciferase Mycoplasma Detection Kit(TransGen Biotech)。其中MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit(LONZA)可以检测大约180种支原体,本文以该试剂盒为例,探讨在Tecan Spark 多功能微孔板检测仪上实现支原体的快速、简单检测。
1 实验设计
采用自制支原体样本,进行2倍梯度稀释,合计7个梯度,并准备8个细胞培养上清样本进行实验,检测细胞样本是否有支原体污染,所有样本做两个复孔。
2 试剂和仪器
MycoAlert PLUS Mycoplasma Detection Kit(LONZA),96孔白板(Costar),支原体样本(自制),待测细胞培养上清样本(自制);Spark多功能微孔板检测器(含注射器);移液器,枪头等。
3 实验步骤与结果判读(如下)
4 微孔板检测仪工作流程
Injector A | Volume:100ul |
Sharking | Duration:3sec |
Wait | Time:5 min |
Luminescence | Name:A |
Injector B | Volume:100ul |
Sharking | Duration:3sec |
Wait | Time:10 min |
Luminescence | Name:B |
Move Plate | Out |
5 结果
支原体样本和待测细胞上清样本的发光测定数值和结果如下:
5.1 支原体样本
5.2 细胞培养上清样本
由上表可知,支原体样本在7个梯度稀释下,均呈现出B/A ratio>1.2,即理论和实际检测的结果相符。而细胞培养上清样本的B/A ration均小于1,即待测样本无支原体污染。
6 结论
采用Spark 多功能为孔板间检测器,配合使用目前市面上提供的酶法支原体检测试剂盒,可以实现半自动化的实验过程,即只需要准备试剂和加入待测样本,后续均可以由仪器完成试剂加入、混匀、检测等步骤,无需人工干预。配合使用Magellan软件,可以对结果进行分析并直接给出测试结果和报告。整个测试的过程<20分钟,是细胞培养过程中,支原体污染检测的强有力工具。
Tecan Spark多功能微孔板检测仪(酶标仪)是目前市面上最为高端的酶标仪之一,包含了多个检测和辅助模块,如吸光度检测,荧光检测,发光检测,二氧化碳培养箱功能,自动开盖与双自动注射器,明场成像等。各模块可以独立或联合使用,其超低杂光率(<10-6)的高速光栅(HSM)更是一绝,200-1000nm全波长扫描耗时<5秒,加上融合光路设计、各模块专用检测器等配置,使得仪器不仅有稳定的检测性能,>10年的使用寿命,还具有极其广泛的应用范围,是目前不可多见的研究工具之一。
参考资料
帝肯(www.tecan.com)是全球领先的生物制药、法医学和临床诊断实验室仪器和解决方案供应商之一。公司专门从事生命科学领域实验室自动化工作流程解决方案的开发、生产和分销。其客户包括制药和生物技术公司、大学研究部门、法医和诊断实验室。作为一家原始设备制造商(OEM),帝肯也是开发和制造OEM仪器和部件的佼佼者,然后由合作公司分销。公司于1980年在瑞士成立,在欧洲和北美均设有生产、研发基地,并在52个国家设有销售和服务网络。2018年,帝肯销售额为5.94亿瑞士法郎(6.06亿美元;5.16亿欧元)。帝肯集团的注册股份在瑞士六大交易所(TECN;ISIN CH0012100191)交易。
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帝肯官网:www.tecan.com
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