2020-09-19 03:34:26 艾杰尔-飞诺美(Agela & Phenomenex)
在医药行业中,碱性化合物譬如各种生物碱的HPLC分析一直是色谱工作者面临的挑战之一。对于一般的非极性化合物,我们可以利用反相色谱柱基于不同疏水性进行分离。但是,碱性物质通常会与硅胶基质色谱柱表面的自由硅烷醇基发生次级相互作用,导致峰发生拖尾。从HPLC诞生起, 色谱柱制造商就在不断尝试不同的策略,以求改善碱性化合物的峰形。今天就让我们一起来了解一下在这条路上,色谱工作者以及制造商们究竟做过哪些努力。
你知道吗?
早期的反相色谱柱是基于“ A型”二氧化硅制造的。这种填料具有大量的金属污染,从而导致二氧化硅表面的硅烷醇基更具活性。因此,在进行C18键合之后,我们会尽可能进行封端修饰,以减少可能发生离子交换的位点数量。尽管如此,碱性化合物仍然会出现严重的拖尾。为了改善其峰形,色谱学家会采取各种方法,譬如:
在低pH下工作,从而中和二氧化硅表面的硅烷醇基团,防止其发生离子交换。或者在流动相中添加竞争性碱(或硅烷醇抑制剂);
或者在流动相中添加竞争性碱(或硅烷醇抑制剂),通过其与硅烷醇基团结合,来降低分析物与之相互作用的可能性。
这种方法虽有一定效果,但通常会导致色谱柱寿命缩短。因为硅烷醇抑制剂往往会使色谱柱固定相以及封端基团加速水解,暴露出更多的二氧化硅,从而导致之后更严重的拖尾现象。
随后,色谱柱制造商们开始引入一种碱钝化硅胶(base deactivated silica BDS)基质的色谱柱。该方法通常采用A型二氧化硅材料并对其进行清洁以去除表面的金属污染。例如,使用磷酸溶液作为螯合剂,以在材料进行键合以及封端之前除去表面金属离子。这类材料通常会显示出比未经处理的“A型”二氧化硅更好的峰形。
接下来一个重大的进步是超纯二氧化硅的出现,这类材料通常被称为“ B型”二氧化硅。因为采用了超纯试剂制造,此类二氧化硅包含了低ppm数量级的金属离子。同时,二氧化硅颗粒的均质性确保了二氧化硅表面上硅烷醇分布的均匀性,从而使固定相能更好地键合在整个颗粒表面,提高键合相的覆盖度,及封端程度的一致性。这样一来,不仅碱性化合物的拖尾明显减少,而且对于与金属能产生螯合作用化合物的损失也大大降低。当使用B型材料时,就无需再使用硅烷醇抑制剂,但大多数方法仍采用低pH值作为防止离子交换作用产生的手段。
如今,杂化材料方兴未艾。这种材料的出现大大扩展了HPLC填料在高pH条件下的稳定性。这项新的填料技术使用户可以使用高pH值的流动相,使碱性化合物去质子化,从而增加其疏水性,延长保留时间,同时消除了离子交换的可能性。尤其是对于极性碱性化合物,此方法特别有效。因为良好的峰形与保留时间的增强都是我们所希望看到的。尤其是在LC-MS / MS中,在较高的有机流动相条件下洗脱,对于提高峰响应值是有利的。我们的全多孔颗粒Gemini C18/NX C18以及核壳颗粒的Kinetex EVO C18都是采用杂化技术的耐高pH色谱柱。
除了杂化材料,近些年还发展出一类新型C18色谱柱。它们是在基础硅胶表面添加一定量的正电荷。这种结合使得碱性化合物不仅能够像通常那样通过范德华力得以保留,而且还可以通过静电排斥,减弱带正电的碱性物质与硅烷醇基团发生的离子相互作用。从而使碱性化合物可以在酸性条件下被保留并以良好的峰形洗脱,这点对于质谱检测尤为重要。如果您想尝试此类色谱柱,我们的Luna Omega PS C18以及Kinetex PS C18 都是不错的选择。
三环类抗抑郁药通常用作测试探针以说明峰拖尾情况,该药物成分碱性非常强而且疏水性很强
艾杰尔-飞诺美
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