借助荧光显微镜研究病毒诱导的基因表达

2020-09-19 01:09:45, 徕卡显微徕卡显微系统(上海)贸易有限公司

原文作者：Shuzhen Sim等

内容编辑：张蕾

校对：陈敏婕

登革病毒（DENV）是一种RNA病毒，是引起登革热的病原，属披膜病毒科黄病毒属。早在1779年和1780年先后在雅加达和美国的费城就有关于“关节热”的描述，1869年英国皇家医学会命名为登革热。我国近年在广东、海南以及广西等地区均有发生。雌埃及伊蚊的唾液腺在血液吸食、繁殖以及登革病毒传播中起着关键作用，它可以产生许多免疫因子，以及促进血液吸食的免疫调节、血管舒张和抗凝分子。

来自约翰霍普金斯大学的Sim等人研究了登革病毒（DENV）在埃及伊蚊（Aedes aegypti）唾液腺中诱导的基因表达作用。研究人员发现，DENV感染后，蚊唾液腺的转录组发生了变化，使用微阵列芯片进行基因表达分析，变化的147个转录本表达出不同的功能，包括对病毒传播至关重要的几个方面，如免疫、食血和寻找宿主。

图1 对原始和DENV感染的伊蚊唾液腺转录组的基因表达分析

此外，两个DENV感染性应答味结合蛋白基因（OBPs）的沉默导致单个宿主血液吸食过程的整体滞后，增加了探测的起始时间和成功吸食血液前的探测时间。因此研究人员提出了DENV感染触须并影响味结合蛋白（OBP）基因表达的丰度的假设。

为了验证这一假设，研究人员首先用小鼠DENV超免疫的腹水和AlexaFluor 568标记的抗小鼠抗体对吸血后14天（dpbm；days post-bloodmeal）的蚊子的头部进行免疫荧光标记，后使用Leica荧光显微镜在埃及伊蚊的化学感受器中识别出病毒载量丰富的区域。

// 实验方法

在吸血后第14天，分别将头从DENV感染与模拟感染的蚊子上解剖下来，然后将其压扁在经APES处理的载玻片上，置于4°C丙酮中固定过夜。
将载玻片与对DENV2特异性超免疫的小鼠腹水（在含0.1％Triton X-100和0.2％BSA的PBS中1∶1000稀释），4°C孵育过夜，并在PBS中洗涤3次。
然后将载玻片与AlexaFluor 568标记的山羊抗小鼠IgG在室温下孵育1小时，并在PBS中洗涤3次。
样品加抗淬灭剂的DAPI，并用盖玻片和指甲油密封。
在Leica荧光显微镜下观察。

// 实验结果

结果如下图，其中(A-C)为未受感染的触须,；(D-F)为2-4段感染触须；(G-I)为9-11段感染触须；(J-L)为感染的上颌触须；(M-O)为感染的喙。红色为DENV抗原。

图2 免疫荧光染色法检测DENV在化学感受器中的感染

观察结果显示，被DENV感染的细胞明显存在于感染蚊子的触须上，而模拟感染的对照组则没有。雌性埃及伊蚊触须由13节鞭毛组成，在整条触须中检测到DENV特异性标记，但在近端节段特异性更强。同时在上颌触须和口器上也检测到DENV标记。

此外，研究人员还通过RT-PCR方法检测10和14dpbm埃及伊蚊触须上的DENV载量。相对DENV载量在14dpbm时显著高于10dpbm，表明病毒在化学感受器中复制活跃。

图3 RT-PCR法检测10/14dpbm感染的埃及伊蚊触须上的DENV

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参考文献：

1.https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1002631

2.《临床执业医师手册》