2020-07-28 20:20:27, Waters 沃特世科技(上海)有限公司
上一期氨基酸分析专题中,我们重点关注了氨基酸结构差别对衍生速率的影响。本期我们将继续探讨影响氨基酸衍生的因素。
AccQ·Tag衍生试剂中,发生反应的位点是其中的羰基,羰基带正电荷。而氨基酸上的氨基带负电荷较多,因此能够快速发生反应,实现衍生。
图1. AccQ·Tag衍生试剂结构式
但氨基酸毕竟是两性化合物,带负电荷的氨基也容易接收来自羧酸的质子,这就导致反应速度的下降。特别是酸性氨基酸,以及水解产生的氨基酸,如果无法消除质子化,必然影响衍生效率。
图2. 氨基酸解离示意图
因此,为了保证衍生反应的彻底进行,AccQ·Tag试剂盒中特别提供了pH缓冲液。从下图也可以看出,反应体系pH大于8.2时,方可确保最高的反应得率。
图3. 氨基酸衍生得率与溶液pH值关系
特别要注意的是,水解氨基酸检测时,由于体系中有较多的酸,对反应的得率会有较大的影响。
图4. 不同pH值衍生的氨基酸分析色谱图
如上图所示,加入氢氧化钠改变溶液pH后,反应的得率明显提高。实际应用中,这一方法会改变样品体积,因此较少采用。可以进行氮吹或冷冻离心浓缩,具体方法我们将在后期的《水解氨基酸系列》中专门讨论,敬请期待。
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氨基酸分析FAQ — 确保氨基酸完全衍生(1)
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