2020-06-15 21:10:07, 景杰学术 杭州景杰生物科技股份有限公司
捕集型离子淌度(Trapped Ion Mobility Spectrometry, TIMS)的引入使得蛋白质组学进入了4D新时代。和常规的3D蛋白组相比,新一代的4D-Proteomics™充分利用了第四维离子淌度的信息,实现了更加specific的匹配,在扩大检测深度的同时提高了准确性。此外,离子的淌度分离促进了共流出组分的同分异构体区分,减少二级混合谱图,尤其有利于翻译后修饰位点的精确分析。独特的性能使其成为蛋白组学,尤其是修饰蛋白质组学深入研究的利器。
澳大利亚沃尔特和伊丽莎霍尔研究所(Walter and Eliza Hall Institute, WEHI)是澳大利亚领先的医学研究机构之一,研究方向主要集中在癌症、免疫紊乱和传染病,并逐渐扩展到健康发展和老龄化方面。该研究所拥有超过1000名员工,配备了多台Bruker timsTOF Pro补集型离子淌度质谱,进行4D-Proteomics™技术开发以及临床疾病研究。
为什么对于翻译后修饰(PTMs)的理解是如此重要?
翻译后修饰导致蛋白形成不同的变体,调控着蛋白的功能和定位。细胞或者临床样本可以鉴定到11,000到13,000个基因产物,已报道的翻译后修饰类型超过107种,平均每个蛋白质存在于八种不同的翻译后修饰形式,具有极高的复杂性,仪器检测到的仅仅是冰山一角。我们推测一个细胞内大约存在10,000,000个蛋白变体。我的实验室采用质谱技术来解析蛋白质翻译后修饰在人类疾病中的作用,我们的目标是深入挖掘并尽可能多地关注这些基于PTM的蛋白质变体。
如何将蛋白质组学的分析应用于人类疾病状态的研究?
在传统的Shotgun蛋白质组学中,当我们将肽段信息映射回蛋白质时,会丢失大量的信息,比如去除或忽略了离群肽。在我们的研究中,试图保留这些肽段,甚至根据不同问题进行肽段分级统计,并进行足够的实验重复。这样做时,仪器性能显得非常重要。另一方面是将关注的蛋白或者翻译后修饰进行富集,可以在蛋白质或肽段水平实现,显著提高检测的灵敏性。在我的团队中,我们致力于以肽段为中心的分析方法,通过代表性的修饰肽进行蛋白变体的定性、定量分析。
您认为蛋白质组学和质谱法在哪些应用中最有潜力?
蛋白质组学是一个非常强大和动态的发现工具,它的潜力只受研究者创造力的限制。令我兴奋的领域之一是探索如何利用质谱技术帮助医学研究,比如药物的发现和生物学机制的解析。Bruker timsTOF Pro捕集型离子淌度质谱的出现,推动了临床生物标志物的研究。它的信号具有卓越的长期稳定性,连续运行6到12个月后,仅仅需要一次毛细管清洁。我相信这是MS领域最新的进展之一,将对临床生物标志物研究产生重大影响。
您在研究中使用的高敏感仪器有什么局限性吗?
高灵敏仪器有助于我们发现更多的离子特征,但不一定意味着更多的鉴定量。我们发现有大量的母离子共洗脱现象,导致匹配的肽段数目只有较低水平的增长。这个限制因素是仪器的硬件,不管是在数据依赖(DDA)或非依赖(DIA)的采集模式下运行。另一方面,离子利用率也是很重要的。在DDA或DIA采集模式下,只使用一部分母离子通过四级杆进行后续的采集,其余离子被损失掉,导致离子利用率低。此外,扫描速度也显著制约蛋白鉴定、定量。比如在DIA采集时,需要对低质量到高质量的窗口逐个扫描,大部分情况下一个循环接近4秒,周期较长。
您认为如何提升数据采集模式?
使用短梯度纳升液相时,色谱峰宽较窄,如果采用上述4秒周期的采集方法,就难以覆盖到完整的色谱峰形态,导致鉴定失败或定量不准确。几年前,Joshua Coon提出了一个观点,认为蛋白质组学比以往任何时候都需要更好的色谱方法。我认为更大的问题是,采用更好的色谱和更高灵敏度的仪器,可能会意味着我们将看到更多共洗脱的等质量肽段,不利于精确的鉴定。然而,我相信随着离子迁移率的增加,引入了一个正交的分离步骤可以显著提高仪器的有效峰容量,减轻共洗脱的影响,促进蛋白质组的深度鉴定。
为什么离子迁移率(IMS)不能在所有质谱仪上实现?
这归结为仪器的复杂性、离子损失和利用率等因素。我认为TIMS设备是难以置信的突破性技术,它是迄今为止我在职业生涯中看到的最激动人心的仪器发展。它的尺寸紧凑,使它能够放置在仪器的前端,保持一个合理的占地面积,并具有优越的稳定性。此外,淌度的引入增加了有效分辨率,简化了样本复杂性。另一个显著的优点是TIMS具有离子捕获累积功能,duty cycle接近100%,提高了仪器的灵敏性。
通过提高离子的数量可以实现怎样的目标?
通过TIMS的离子累积作用最大化离子束,并利用正交分离来进行蛋白质组的深度鉴定,一定有很多团队在进行相应数据采集、分析方法的开发。timsTOF Pro根据淌度、m/z筛选母离子,并将碎片离子与母离子进行匹配。根据母离子的信号强弱,判定二级采集的次数并将二级信号进行累积,从而增强检测的灵敏度,并且由于多维分离,二级谱图的归属性更加特异。当我们查看数据时,印象深刻的一件事是图谱的高保真度和MS2碎片的丰富性。
准确的CCS值也有助于实现临床应用吗?
碰撞截面积(Collision Cross Section, CCS)是肽段固有的离子特征,CCS值的准确、稳定测量,为肽段的检测提供了多一维的信息,这一点是非常重要的,将有助于分析方法的发展。我们采用CCS值进行母离子的匹配和分析,能够有效提高匹配的准确性。我相信这将开辟一个机会,开发新的工具和软件,使我们不仅深入挖掘蛋白质组。我们还需要进行非常大的样本队列测量,很期待看到未来有哪些进展的发现。
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