2020-06-14 10:02:18, 美谷分子仪器 美谷分子仪器(上海)有限公司
优势
请输入
单细胞分离效率 > 80%
提高单细胞克隆成活率,同时降低交叉污染风险
轻松生成单克隆性文件
简单的向导式报告功能,包括导出细胞区域、杂质区域以及全孔
在生物药物分子(如抗体)的生产过程中细胞株开发及单克隆性确认是非常关键的步骤。细胞株开发起于将表达目的蛋白的基因转入宿主细胞。通过分离高效表达目的蛋白的单个活细胞即可建立细胞株。在这个过程中,单克隆性的记录至关重要,用于确保细胞株的基因重现性。随后的步骤涉及细胞克隆的产量、质量和稳定性的表征(图 1)。
当前细胞株开发的工作流程有一些局限,如低细胞活率、低效的单细胞分离以及有限的单克隆性证据。有限稀释,一种传统分离单细胞的方法,依赖于统计概率,无法提供单克隆性的可视化证据。此外,该技术的效率非常低,最终导致每块微孔板上可供筛选的克隆非常少。
CloneSelect 高通量单细胞分离系统是一个新颖的台式设备用于柔和精确地从液体样品中分离出单个活细胞。单细胞分离系统采用微流控分离槽以精确地分离单个细胞,同时最小化分离不同细胞可能带来的交叉污染的风险。当单细胞分离系统与 CloneSelectTM Imager (CSI) 细胞生长分析系统的快速成像技术配合,可以显著提高细胞株开发流程的效率。
这里,我们将介绍结合单细胞接种和单克隆性验证的工作流程。我们利用单细胞分离系统和 CSI 接种单细胞至微孔板,然后确认这些细胞的存在并记录他们在随后几天里的生长过程。最后,我们将介绍如何生成包含单克隆性证据的文件用于提交监管机构审批。
Clone Select 高通量单细胞分离系统
材料和方法
☆
准备细胞样品
单细胞分离和有限稀释都采用 CHO-K1 细胞 (ATCC)。其他细胞,包括 HEK 和 L929,也采用类似的准备方式。为了单细胞分离实验,用低浓度血清 (1%) 培养基或 PBS 制备密度为 1×106个/ml 的细胞样品。加样至分离槽前用 40 μm 的过滤器 (Corning,431750) 处理细胞样品以避免凝集。
☆
分离槽和微孔板水平的成像和效率
静置待细胞沉降至孔底后用 CSI 或 CSI-FL 对微孔板成像。检查每个孔保存的喷嘴图像以计算单细胞分离的效率。为了在微孔板水平计算单细胞分离的效率,在有限稀释或单细胞分离前用荧光染料 (1 μM Calcein AM,Molecular Devices) 标记 CHO-K1。
用 CSI-FL 对微孔板成像,并利用细胞计数功能计算细胞数目。在第 10 天评估单细胞孔的活率,其他孔的数据排除分析。
仪器概览和工作流程
01丨单细胞分离
单细胞分离系统是一款新颖的桌面型设备用于柔和并精确地从液体样品中分离出单个活细胞。系统利用一次性的分离槽,因此在分离不同细胞时最小化交叉污染的风险。
一个分离槽单次运行可接种细胞至多块 96 孔板或 384 孔板。为了接种单细胞,单细胞分离系统采用压电驱动器产生微小液滴(图 2A)。
一个高分辨的相机连续对分离槽的喷嘴部位采集图像,与此同时图像算法分析喷嘴末端区域以检测是否存在单个细胞。当液滴中含有零个或多个细胞时,真空泵工作将液滴吸走。当算法确认是单个细胞时,真空泵被关闭,包裹单个细胞的液滴落入微孔,单细胞分离系统的打印头移至下一个微孔。
02丨分离槽喷嘴水平的单克隆性证据
分离槽的喷嘴部位采用高景深的相机成像以实现 > 99% 的细胞被聚焦。当检测到液滴中含有单个细胞时,连续的 5 张图片会被采集以跟踪单个细胞直至离开喷嘴末端(图 2B)。
图像 1-3 在液滴形成前采集,图像 5 显示液滴挤出后的喷嘴。图像4中叠加用户设定的圆形区域,为单细胞事件设定界限。喷嘴水平的图像可作为微孔板图像的补充。
我们观察到喷嘴图像和孔板图像之间有着非常高的相关性 98.9% ±1.8(n = 282 个孔)。
03丨CSI 轻松完成微孔板成像和单克隆性报告
CloneSelect Imager 可实现快速一致的微孔板成像。可在 90 s 内完成一块 96 孔板或 384 孔板的成像。分析算法基于白光图像可以无标记定量地分析细胞汇合度 (confluence)。
CloneSelect Imager
在本次实验流程中,经有限稀释或单细胞分离系统制备的细胞孔板被 CSI 跟踪观察超过10 天。在孔板缩略图标签页,绿色为细胞克隆。
04丨利用报告功能轻松记录单克隆性
CSI 的报告生成功能利用向导式的软件可以快速设置、自定义报告并最终提交监管机构。用户可以用两种方式阐明孔内不存在第二个细胞:
1) 显示所有区域的时间序列图像(图 4A);
2) 展示可疑物体的时间序列图像(图 4B)。
因为类似细胞的碎片会使确切评估第 0 天的单克隆性变得困难,圈定碎片区域并展示时间序列证明其没有发生分裂可以增强判断信心。
结果展示
单细胞分离系统和有限稀释接种单细胞的效率
为了评估单细胞分离系统接种单细胞的效率,我们分析了分离槽喷嘴的图像以确认液滴进入微孔前都观察到了单个细胞。
基于喷嘴区域的图像分析,单细胞分离系统实现了 88.5% ±5.5(n=9 块微孔板)的单细胞接种效率。两个细胞和零个细胞发生的比例非常低(分别为 6.7% 和 4.8%)。
每块 96 孔板的平均处理时间为 8.1 ±2.8 分钟。如示意图所示(图5A),经单细胞分离系统处理的一块 96 孔板中含有 85 个单细胞孔,6 个多细胞孔和 5 个空孔。
相对地,0.5 个细胞 / 孔的有限稀释理论上可以得到 30% 的单细胞孔,10% 的多细胞孔和 60% 的空孔。如示意图所示(图 5B),有限稀释处理的一块 96 孔板可以产生 28 个单细胞孔,10 个多细胞孔以及 58 个空孔。
图 5C 直接比较了单细胞分离系统和有限稀释产生空孔、单细胞孔和多细胞孔的比例。相比有限稀释,单细胞分离系统将单细胞接种的效率提升了 ~3 倍,这意味着有更多潜在的克隆可被下游分析。
克隆成活率
我们比较了单细胞分离系统和有限稀释的单细胞克隆成活率。为了计算活率,我们将有限稀释或单细胞分离系统处理的微孔板放入 CSI 定期成像直至第 10 天形成明显的克隆。
图 6A 为经单细胞分离系统处理的一块代表性微孔板在第 10 天的图像,从中可见单克隆的孔占据明显的多数 ( 共 70 个孔 )。相对地,图 6B 为有限稀释处理的微孔板,其中仅有 27 个单克隆的孔。
计算每个孔内的克隆数目并分成 3 类:空孔,单个克隆的孔以及多个克隆的孔。我们观察到单细胞分离系统可以产生 63.0% ±6.5 的单克隆孔(另外有 1.5% ±1.4 的孔含多个克隆,35.5% ±7.3 的孔没有克隆)。
同时,我们发现有限稀释可以获得26.2% ±2.3 的单克隆孔(另外 66.4% ±3.9 的孔没有克隆,7.4% ± 1.9 的孔含多个克隆)。图 6C 比较了单细胞分离系统和有限稀释获得单克隆孔的比例。
为了直接检测单细胞的活率,荧光染料标记的细胞被用于实验并采集第 0 天的图像, 随后继续培养 10 天。将给定微孔板的单克隆孔的数目除以单细胞孔的数目就能得到活率。我们发现单细胞分离系统的平均活率为 84%, 而有限稀释的平均活率为 81%。
采用类似方法,我们比较了单细胞分离系统接种不同细胞株时的活率(图 6E)。一般而言, CHO、HEK 以及其他常见细胞株的典型活率超过 75%。需要注意的是不同细胞株类型、样品制备过程、分离参数设定、培养基以及其他外部因素会对细胞活率产生影响。
在这里,我们介绍了 CloneSelect 单细胞分离系统和 CloneSelect Imager (CSI) 细胞生长分析系统组合应用的工作流程,它可以提高单细胞接种的效率并记录单克隆性。
单细胞分离系统在高效快速接种单细胞的同时维持高细胞活率并最小化交叉污染的风险,还为单克隆性提供了图像证据。
高效 (> 85%)接种单细胞意味着可以更充分地利用微孔板。CSI 可以对细胞孔板快速成像,表征单细胞生长形成克隆的过程。利用 CSI 的分析功能将克隆生长过程的分析变得简单,利用自动报告生成功能可以快速获得完整的单克隆性报告。
在这个工作流程中,克隆形成率上的 3 倍提升意味着更多的克隆可进入后续的分析,从而在提高工作效率的同时节省人工和试剂成本。
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