重磅发布！方法开发系列-HPLC缓冲液选择篇

     对于给定的官能基团，在pH值范围内接近pKa时，可观察到化合物保留的剧烈变化。

图1. 离子化合物化学解离

    最后两个方程通常称为亨德森-哈塞尔巴赫（Henderson-Hasselbach）方程。这些方程表明，在pH值离pka较远的位置，较小的pH值变化对非质子-质子种类的比例影响很小。因此，中等pH值变化不会对保留产生明显影响。pKa附近pH值的微小变化，会对两种物质的比例产生明显的影响。因此，改变接近pKa的pH值，会明显影响化合物的保留。当pH值作为增加化合物保留的手段时，考虑方向应该是尽量降低分析物的离子化。

    缓冲液是弱酸与其共轭碱，或弱碱与其共轭酸的溶液。

    缓冲液降低氢离子/水合氢离子和氢氧根离子的影响，从而较少包括稀释在内的pH值波动。反相模式下，经典的硅胶基质填料的pH值耐受范围是2-8。缓冲液的选择通常由所需的pH值决定。缓冲液的pKa必须接近所需的pH值，因其在pKa处最容易控制pH值。经验法则是选择一个pKa值<2个单位的所需流动相pH的缓冲液(见下表)。

表格1.不同缓冲液的pHa值与有效的缓冲范围

      目前比较常见的问题是缓冲液与质谱(MS)检测兼容性。解决挥发性问题的首选缓冲盐是甲酸盐、醋酸盐和氨溶液。在离子化抑制方面，甲酸盐和醋酸盐是正离子模式检测的理想选择。即使在正离子模式下，TFA也会产生负面影响；在负离子模式下，TFA会强烈抑制电离作用。醋酸对负离子模式是很好的选择。LC-MS应用进一步限制缓冲液种类和浓度的选择。

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