基因组装也可以随心所欲了？

“大师兄，这个克隆应该用哪个载体、怎么设计酶切位点啊？”

“大师兄，插入和载体根本连不上啊，平皿都不长菌！”

“大师兄，这个克隆做完之后留疤了，不知道会不会影响 DNA 完整性和 mRNA 正确折叠，蛋白表达不出来怎么办？”

“大师兄……”

“大师兄我毕竟也是从一次又一次的失败中走过来的，自己想吧”

近年来，合成生物学和代谢工程学在飞速发展，更迫切需要方便，有效且通用的基因操控手段。其中之一便是多个基因元件的组装，如编码酶的序列，功能性融合标记，启动子、终止子和核糖体结合微店等控制元件。

常用的限制性酶及基于序列的体外连接反应受限于独特的限制性酶切位点的有限性。PCR、酶切、跑胶、切胶回收、连接等费时费力，几乎是每个科研工作者的日常噩梦。限制性酶消化产生的单链 DNA 突出，通常长度为 2-8 核苷酸，难以在单一步骤中重组多个大片段的 DNA 碎片。

科学家们都在努力尝试安装多个大片段 DNA 插入片段和构建大于 10kb 的质粒。我们在这里介绍一种简单可靠，强大可扩展的基因组装方法，CLIVA。

CLIVA 是 cross-lapping in vitro assembly 的缩写，体外交叉组装，由 Ruiyang Zou 等科学家研发优化。硫代磷酸修饰过的核苷酸，可使用酒精溶液中的碘进行高效的位点特异性切割，CLIVA 正是利用了这一特性进行切割。最近 Milan Blanusa 等科学家使用了硫代磷酸化学特性去组装了多个小的蛋白结构域。区别于这个方法，CLIVA 是一种新的交叉设计，可利用最优定位的硫代磷酸修饰核苷酸的切割和选择性阳离子，来产生较长的同源突出序列（36-38 碱基）用于高效组装。

在 Ruiyang Zou 的论文当中，他们阐述了 CLIVA 的用途，总共构建了 16 个质粒，片段范围从 7.8 到 21.6 kb。这些质粒编码了大肠杆菌中 1-Deoxy-Dxylulose 5-phosphate（DXP） 合成通路的多个基因的组合。这个方法可在 2 天内，不依赖于酶在载体上安装多个大片段 DNA 插入片段和构建大于 10 kb 的质粒，简单、快捷、高效。

CLIVA组装策略示意图

高效组装

铺垫了这么久 CLIVA，是因为 CLIVA 流程简单、通用性强，非常适合实现全流程自动化。

CLIVA流程分步

系统设计图

※自动化平台仪器构成：

PF400 5 轴高精度机械臂（2 米导轨）：耗材在不同仪器之间的运输及微孔板的开关盖；

QPix HT 多功能微生物处理仪：转化样品的加样及涂板、克隆挑取、复制重排等；

Biomek i7 液体处理工作站：反应体系的建立及基于磁珠的核酸纯化；

A4S 热封膜仪：PCR 板的热封膜，用于下游的PCR扩增、高温孵育及样品保存；

HiG-4 离心机：微小反应体系的瞬时高速离心，确保所有反应液都聚集在孔底；

ODTC 电动热盖 PCR 仪：自动运行 PCR 扩增或高温孵育；

XPeel 撕膜仪：PCR 仪孵育后，去除 PCR 板上的封膜，进行下游的液体处理；

LPX110 耗材旋转堆栈：可存储微孔板、PCR 板、深孔板、固体培养基培养板、吸头等耗材；

STX44-IC 自动化振荡培养箱：可在线培养细菌；

SpectraMax iD3 酶标仪：细菌浓度或 DNA 浓度的检测。

系统真机展示

*流量预警：142M

自动化系统优势

基因组装自动化流程: 从 DNA 模板到质粒；

操作简单：

高通量: 480 质粒/运行；

高效：60 小时 / 480 质粒，包括 16 小时的平皿静置培养及 18 小时的深孔板震荡培养时间；

程序运行时，非必需仪器可离线使用；

程序运行时，即使发生错误，如仪器工作超时（timeout）、仪器无响应或机械手探测不到耗材，都可暂停运行，人工解决仪器的报错、重新连接仪器或重新校准机械臂位置等，再重新继续中断的实验。无需从头开始；

可同时运行多个自动化程序（simultaneous execution）或定时运行（schedule）；

兼顾其他实验：细菌生长监控、浓度定量及均一化、微生物进化实验；

Molecular Devices 独有生物样品自动化流程开发及验证服务！用户高枕无忧！

QPix HT自动拍摄的图片及准备进行挑取的克隆，前面的CLIVA制备及细菌转化涂板均自动完成

基因组装，

就是这么简单！

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