核酸质谱技术在遗传产前检查中的应用

2019-12-06 12:26:42 北京毅新博创生物科技有限公司

遗传产前检查及遗传咨询，是指妊娠期对孕妇和胎儿进行临床检查，或对新生儿进行临床检查，以此观察有无病理变化引起的高危妊娠，能够及早发现并防治各类产妇疾病和胎儿遗传病，把新生儿的遗传不利影响降至最低。目前防治胎儿或新生儿的各类遗传性疾病（如新生儿溶血症、软骨发育不良等）成为遗传产前检测的主要项目。

（一）新生儿溶血症

新生儿溶血症于1609年最先由法国助产士Loise Borgios发现。她曾接生过一对双胞胎，其中1个发生水肿，另1个发生黄疸，2人均于产后立即死亡。那时，不知这种病的发病原因与发病机理。1940年Landsteiner与Wiener于发现人类ABO血型系统后40年发现导致人类发生新生儿溶血症的RhD抗原，这才解决了这种病的病因与发病机制问题。

Rh血型非常复杂，有52个抗原及许多表型，在临床上很重要,因为这种血型系统涉及新生儿溶血症,溶血性输血反应和自身免疫性溶血性贫血。Rh阴性妇女妊娠有时会并发胎儿或新生儿溶血症(Hemolytic Disease of FetusorNewborn, HDFN)，尤其是当Rh阴性孕妇怀Rh阳性胎儿时。胎儿或新生儿溶血症,轻则发生黄疸,重则发生胎儿水肿(hydropsfetalis)，乃至死胎(still birth)，这种现象称之为孕妇同种免疫(alloimmunization)。

Rh阴性的个体在中国汉族人当中很稀有，比率约为0.3%左右，而在欧美等白种人或中国少数民族中，比例较高，有的可高达15%左右。Rh血型不合的输血，有可能产生危及生命的溶血性输血反应，母子Rh血型不合的妊娠有可能发生新生儿溶血病，严重者可导致新生儿死亡，或是使胎儿死于子宫内。因此Rh血型的检查和ABO血型同等重要，已被列为血型的常规检查之一。

正常Rh阴性者，血浆中不含抗-D抗体，所以当Rh阴性的人第一次输入RHD阳性血液时，不会发生凝集反应，但此时Rh阴性者却会由于各种免疫而产生抗D抗体，当再次输入Rh阳性的血液时，就发生严重的输血反应甚至造成死亡。所以当Rh阴性的妇女怀有Rh阳性的胎儿，胎儿的红细胞就会刺激母体产生抗-D抗体，当再次怀有Rh阳性的胎儿时，就会导致新生儿溶血性贫血而死亡。

Rh阴性是由于RHD基因的相关突变造成的，主要有弱D、部分D及DEL型这3大类。中国人的Rh阴性分别主要为：第9外显子的G1227A突变(Lys409Lys，DEL型，占将近30%)、第6外显子的G845A突变(Gly282Asp，弱D15型)以及D^ⅥⅢ(外显子3-6缺失，部分D)。对以上位点的检测，基本可覆盖中国人Rh阴性血型的分子表型。

（二）软骨发育不全（Achondroplasia，ACH）

软骨发育不全是最常见的软骨发育异常类疾病，活产儿的患病率为1/30000-1/10000。ACH是完全外显的常染色体显性遗传病，85%为散发。ACH的诊断主要依靠患者的临床症状、体征、放射学检查以及家族遗传史，其特征性的表现包括身材矮小、巨头、前额突出、鼻梁塌陷、四肢近端肢体短但智力正常；X线检查可见颅盖大、顶骨及枕骨隆突、长骨短、椎体厚度减小、骨盆狭窄等。1994年ACH的致病基因被定位于4p16.3；随后证实成纤维细胞生长因子受体3（Fibroblast Growth Factor Receptor 3，FGFR3）基因跨膜区第10外显子第1138位核苷酸的突变是23例ACH患儿的致病原因。迄今为止，已经发现了多种导致ACH的基因突变，其中95%以上为FGFR3基因第10 外显子第1138 位核苷酸的突变。软骨发育低下（Hypochondroplasia，HCH）的遗传形式和临床表现与ACH类似，但症状较轻。至今约有60%的HCH被报道存在FGFR3 基因第13外显子第1620位核苷酸的突变，此外，致死性侏儒（Thanatophoric Dysplasia，TD）等其他遗传性疾病也是与FGFR3基因其他位点突变有关的骨骼发育障碍性疾病。尚有学者发现ACH患者FGFR3 基因第10外显子1180A>T（p.Thr394Ser）新的错义突变，也位于FGFR3基因跨膜区。FGFR3基因突变检测有助于以上疾病的诊断和鉴别诊断。

在早期，遗传产前检查方法包括：超声筛查、血清学筛查等。其中血清学筛查常用的标志物有AFP、HCG、PAPP-A等。近年来，血清学筛查中采用了现代分子生物学技术，使得血清学筛查结果更加精确操作更加简便易行，筛查周期更长并降低在筛查中对孕妇的伤害。

对于常规的血清学筛查方法而言，往往采取绒毛活检或者羊水穿刺取样，进行胎儿染色体核型分析或基因检测获得确切的结果明确诊断。但无论何种方法，侵入性诊断始终存在约0.5%-1.0%的胎儿丢失率，并且对于产妇和胎儿均造成一定伤害。

随着技术的发展，20世纪70年代早期Leon等就证实在肿瘤患者细胞中DNA量的增加。随后在20世纪80-90年代，多个课题组证实肿瘤患者中血浆DNA有肿瘤特异性，即血浆中存在肿瘤细胞来源的DNA。根据这些启示1997年Lo等采集妊娠12-40周健康孕妇的外周血，用快速煮沸法从血浆及血清中提取DNA，用PCR技术检测睾丸决定基因(SRY)特异序列(DYSl4)确定了胎儿DNA的存在。

孕妇血浆中游离胎儿DNA主要有3种组织来源：一是来源于胎盘；二是来源于进入母体血循环的胎儿造血细胞发生凋亡；三是胎儿DNA分子直接通过胎盘转移进入母体血浆。目前认为胎盘是最主要的来源。

1997年胎儿游离DNA的发现为无创性产前诊断开辟了新的途径。母血循环中的胎儿游离DNA含量相对较高，获取方法比较简单，在早孕阶段就可以检测到，这些优点成为极具潜力的无创伤性产前诊断方法。目前，胎儿游离DNA已经应用于某些性连锁疾病、妊娠相关疾病、染色体病、胎儿RhD血型检测等很多疾病的产前诊断中，例如：利用孕妇外周血中胎儿细胞诊断胎非整倍体异常、利用孕妇血浆中游离胎儿DNA检测胎儿非整倍体异常、利用孕妇血浆中细胞游离胎儿mRNA检测胎儿非整倍体。以上技术仍然以免疫荧光核酸杂交法或PCR检测法为主，并未出现新的核酸检测方法。另外，传统的胎儿产前诊断是依靠从绒毛或羊水中获得胎儿DNA，然后对胎儿组织DNA进行基因的扩增，该方法为侵入性取材，有引起胎儿流产以及加重胎儿病情的危险。

在各种对核酸的检测平台中，核酸质谱仪被认为是很有发展前途的仪器，尤其是基质辅助激光解析电离飞行时间质谱，即Matrix-Assisted LaserDesorption Ionisation-Time-Of-Flight Mass Spectrometry（MALDI-TOF-MS）是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱。仪器主要由两部分组成：基质附助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）。MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。TOF的原理是离子在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测即测定离子的质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比，检测离子。MALDI-TOF这种软电离技术，不产生或产生较少的碎片离子。由于分子量是有机化合物最基本的理化性质参数，分子量正确与否往往代表着所测定的有机化合物及生物大分子的结构正确与否。

MALDI-TOF-MS基因分型技术基于“引物延伸法”，即延伸引物在待检测位点上延伸一个或若干个碱基，然后根据延伸产物所带荧光的不同或其分子质量的不同而确定其基因型（图1）。

图1

因此，基于MALDI-TOF MS，各大公司开发了一些基于突变或多态的核酸检测方法，如美国Agena公司的MassARRAY iPLEX方法，德国Bruker公司的GOOD assay方法，韩国GeneMatrix公司的RFMP方法，以及北京毅新博创生物科技公司的Clin-TOF方法。这些方法的原理是设计一条与待检测位点上游的基因组序列匹配的寡核苷酸探针，根据单碱基位点的基因型差异，探针将在待检测位点处连接上不同的脱氧核苷酸。其中，组成DNA片段的四种脱氧核苷酸的分子量分别是：dAMP 313.21Da，dCMP 289.19Da，dGMP 329.21Da，dTMP 304.20Da。不同脱氧核苷酸之间是存在分子量差异的，其中差异最小的是dAMP与dTMP之间的9.01Da，差异最大的是dCMP与dGMP之间的40.02Da，通过质谱仪能检测到这种差异，从而将分子量不同的探针区分开来。质谱仪的检测效果与探针的分子量相关，探针片段越短，分子量越小，区分效果越明显：例如，在图2中，图2-A标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGT-3'和5'-ACGA-3'，分子量分别为1174.699和1183.770Da，相差9.071Da，B图标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGTACGT-3’和5'-ACGTACGA-3'，分子量分别为2410.628和2419.821Da，相差9.193Da，图2-C标示的两个峰，对应的两个寡核苷酸片段为5'-ACGTACGTACGT-3'和5'-ACGTACGTACGA-3'，分子量分别为3645.917和3654.736Da，相差8.819Da，同样相差9Da左右，因此，MALDI-TOF-MS能够灵敏且准确地测量出单个碱基差异。但如图所示，图2-A中两个峰之间的差异最明显，图2-B次之，图2-C中两个峰之间的差异相对不明显，也就是说，分子量越小，质谱仪的区分效果越明显，即分辨率越高。为了提高质谱仪的分辨率，对单碱基位点进行检测倾向于检测分子量较小的寡核苷酸片段，如RFMP方法通过对含目标检测位点的PCR产物进行限制性酶切，产生2000~4000Da左右的寡核苷酸片段进行检测，而GOOD assay方法通过磷酸二酯酶（Phosphodiesterase，PDE）将含目标检测位点的寡核苷酸片段切割成1000~2000Da左右的小片段进行检测。