MALDI－TOF MS指纹图谱技术在病原微生物分型中的应用前景

病原微生物感染仍然是威胁人类健康的主要"杀手" 。同一种属微生物型别繁多，但很多临床感染是由某一种属病原体的小部分亚型引起的。而且根据病原体分型情况可对医院感染进行有效监控。因此对微生物准确、快速、灵敏地分型对追踪分子溯源、明确传播途径、探索致病机制和指导临床用药等具有重大意义。传统表型分型方法包括血清型分型、耐药谱分型等，比较直观，但是分辨率较低。基因水平分型的方法主要包括质粒DNA分型、染色体DNA分型(脉冲场凝胶电泳分型、核糖体分型等)和PCR分型(依据PCR后测序的核苷酸序列不同进行分型，主要包括限制性片段长度多态性PCR和多位点序列分型等)，是从遗传学及种系角度对病原菌进行分型，辨别能力强，重复性较好。但因其技术专业性强、价格昂贵等缺点，未能在各级别医院中广泛应用。传统的病原微生物分型方法在微生物的诊断和监控中很难标准化，而且也很难实现高通量和自动化。

近年来基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI－TOF MS)以其快速、准确、重复性好、高通量的特点在细菌的鉴定、耐药性和毒力的监测中发挥越来越重要的作用^[1,2]。MALDI－TOF MS指纹图谱分型方法也日益受到关注，MALDI－TOF MS技术不仅能够将临床病原体鉴定到种/亚种的水平，同时也具有良好的分型能力^[3]，并逐渐被应用到细菌、真菌和病毒的分型中。

MALDI－TOF MS指纹图谱分型的原理是建立在MALDI－TOF MS鉴定微生物的基础上，利用核心图谱(the main spectra，MSP)建造标准蛋白指纹图谱库，主要采用主元素分析(principal component analysis，PCA)进行数据处理。MALDI－TOF MS质谱图的构建是以检测到的离子质荷比(m/z)为横坐标，离子峰强度为纵坐标形成的，通过对得到的病原体鉴定质谱图与标准数据库图谱比对，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定^[4]。图谱中主要的分子离子峰为菌体内高丰度、表达稳定、进化保守的核糖体蛋白，因此可以通过聚类分析获得微生物间的进化和亲缘关系。MSP采用明确鉴定的病原菌蛋白指纹图谱建造标准蛋白指纹图谱库作为质谱指纹图谱比对的基础，PCA是一种数据统计方法。质谱仪中PCA原理则是依据该鉴定菌的主要特征分量(蛋白指纹图谱)不同进行建树从而得到微生物的进化亲缘关系。数据的处理和分析都可以通过分析软件来完成。此外，MALDI－TOF MS质谱指纹图谱分型还可以用于细菌的特殊分型，主要依据细菌的蛋白图谱，利用软件建造相关模型，通过筛选出与细菌致病性、耐药以及溯源等有关的生物标记物，再根据相关生物标志物来进行分型。

利用传统的Lancefield血清分型法可将链球菌分为A、B、C、D等18个群。Kumar等^[5]和Lartigue等^[6]利用MALDI－TOF MS可以快速将Lancefield分型的链球菌A、B、C、G群进行正确分型，并能将其中A和B群进行亚种分型。该技术也能对肺炎链球菌进行亚种分型，甚至能区分到有无荚膜^[7]。对人类有致病性的奈瑟菌属细菌主要包括脑膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌，其次是21种没有致病性或机会致病性奈瑟菌。Illina等^[8]利用MALDI－TOF MS能将57株奈瑟菌分成3大类，淋病奈瑟菌、脑膜炎奈瑟菌和其他。15株非致病性的奈瑟菌还可进一步进行分型。Chao等^[9]将MALDI－TOF MS指纹图谱分型应用到真菌的鉴定和分型中。利用MALDI－TOF MS对200株假丝酵母菌株进行鉴定和分类，不仅能将酵母菌鉴定到种或者复合体(近平滑酵母菌复合体、季也蒙假丝酵母菌和皱褶假丝酵母菌复合体)的水平，通过聚类分析还能区分皱褶假丝酵母菌复合体中的两种菌(C. guilliermondii and C. Fermentati)。研究人员^[10]采用该技术对10株A型流感病毒(8株H1N1和2株H3N2)依据核蛋白进行鉴定，可以进行亚种分型，并能把A型流感病毒(H1N1和H3N2)从人偏肺病毒或呼吸道合胞病毒的混合体中分离，可见质谱分型也可用于病毒的检测与分型。

目前基因分型方法是细菌分子分型的常用方法，MALDI－TOF MS质谱指纹图谱分型作为一种新型的分型方法，须与常用的基因分型方法相比较。Rettinger等^[11]采用MALDI－TOF MS质谱指纹图谱分型方法、16S rRNA测序方法和MLST方法对28株钩端螺旋体进行进化分析，发现质谱指纹图谱能很好地区分高致病性(21株)、中间型(3株)和非致病性(4株)的钩端螺旋体，与16S rRNA测序方法得到的进化树结果相同，同一型内各菌株之间相似性很高，但MLST方法却只能区分中间型的钩端螺旋体，高致病性和非致病性的菌株都归于一类。可能因为质谱指纹图谱检测的是核糖体蛋白，由16S rRNA翻译，MLST针对7个管家基因，只有rrs2基因编码16S rRNA，所以与以上2种方法有部分差异。基于基因测序的方法如16S rRNA、23S rRNA和MLST等基因分型方法耗时长、费用高，而质谱以其高通量、快速、重复性高的特点能更快地进行分型。Fujinami等^[12]在研究军团菌的流行传播中发现，MALDI－TOF－MS质谱指纹图谱分型和PFGE分型方法在进化分析时有较好的一致性。但是，MALDI－TOF－MS进化树显示ATCC33153和ATCC33734嗜肺军团菌与其他ATCC菌株不同被单独分类，PFGE中发现，ATCC33154和ATCC33156菌株与其他ATCC菌株不同而归为一类。可能原因是2种方法比较的靶点不同，PFGE的原理是依据限制性内切酶切开全基因组DNA的片段来进行进化分析，而质谱仪比较的是一些细菌中稳定的核糖体蛋白。所以不同种类的细菌的MALDI－TOF MS质谱指纹图谱分型与PFGE分型方法是否有良好的相关性，还需更多的数据去支持。

例如依据特殊毒力蛋白的有无进行高致病型与低/非致病型的菌株区分、依据耐药有关水解酶的有无进行产酶型和非产酶型菌株的快速区分等。Bittar等^[13]发现MALDI－TOF MS检测后4 448 m/z蛋白峰可以快速检测PVL阳性的金黄色葡萄球菌，为高致病力金黄色葡萄球菌的快速诊断以及感控措施的实施提供快速有价值的信息。Lu等^[14]利用MADLI－TOF MS发现95%社区获得性甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(CA－MRSA)有1 774.1 m/z和1 792.1 m/z 2个独特的肽峰(SCCmec Ⅳ或SCCmec Ⅴ的肽峰)，而医院获得性MRSA(HA－MRSA)中则没有，所以这2个肽峰可作为区分CA－MRSA和HA－MRSA的生物标志物。通过这类分型方法可以筛选与细菌致病性、耐药以及溯源等有关的生物标记物，因此有更广阔的发展应用空间。

三、小结

虽然质谱指纹图谱分型具有快速、高通量、易于标准化等优点，但它也有其局限性。首先是质谱鉴定本身的局限性，包括质谱仪本身鉴定能力的局限和数据库的完善程度等。MALDI－TOF－MS对未知细菌分型鉴定必须建立含有足够多已知菌株的谱库，方可实现最匹配的菌株鉴定结果，因此需要统一的建库标准来扩大谱库，提高其鉴定分型能力。其次，分型方法未规范化，由于该分型方法还处于探索阶段，分型方法没有规范化，分型的标准还没有统一。此外分析前标本的质量控制，建立标准的样品制备方法、数据获取和分析方法^[15]，也是质谱指纹图谱分型是否准确、辨别能力是否高的保证。

质谱指纹图谱技术并不能完全替代表型分型和基因水平分型，不同的分型方法反应细菌不同水平的变化，分型方法可以互相借鉴，互相补充。质谱指纹图谱分型可以与基因水平分型结合来扩大对亚种水平的分型能力。

随着高通量蛋白质组学的发展，基于蛋白质组学的质谱技术在细菌的鉴定和分型中发挥着越来越重要的作用。质谱指纹图谱分型是高通量蛋白质组学在微生物中的应用。在医院内病原体暴发时，质谱指纹图谱技术可以作为一种快速、有价值的初级筛选技术，为追溯疾病暴发起源、传播和监控提供强有力的证据。将病原体进行针对不同患者来源的分型，从循证医学角度来实行个体化治疗，从而提高临床治疗率和降低死亡率。MALDI－TOF－MS指纹图谱分型的发展不仅依靠临床微生物专家的努力，还需要质谱技术研发人员、生物信息学专家等群策群力，共同推动该分型方法的发展，MALDI－TOF MS指纹图谱分型技术才能在临床中得到更加广泛的运用。

参考文献：略

本文选自《中华检验医学杂志》，秦娟秀，李敏