“抽丝剥茧”：利用蛋白质组学寻找Zika病毒的寄主因子

景杰生物/解读

编者按：目前，随着科技的发展，人们目前使用的交通工具的革新，世界完全成为地球村，朝发夕至到任意一个地球角落早已成为现实。人们在享受高科技带来的出行的便利时，不可忽视的是众多疾病的传播速度也越来越快。从2005年令中国人心有余悸的SARS；2014年肆虐的Ebola病毒；2015年让孕妇色变的Zika病毒。再到目前肆虐非洲，已经传播到我国的swine fever virus。如何去高效的研究病原微生物的感病机理，研发疫苗和相关治疗药物是非常迫切的事情。

除了全球科研工作者的通力协作外，我们在研究策略和研究工具的变化也是值得科研人员注意到。在遗传水平，利用CRISPR-CAS9进行全基因组knockout筛选；在蛋白水平，利用蛋白质组学，分析感病前后蛋白质的变化；在翻译后修饰水平，利用修饰组学关注感病前后蛋白修饰的变化。上述系统生物学水平的研究工具无疑会大大加速我们的研究，提高人们对疾病的应对速度和防御能力。

2015年的巴西，整个国家正在紧张的备战来年的里约奥运会。 但是从5月开始，全国医院报道陆续出现许多小头畸形的新生儿。在不到半年的时间内，仅巴西就有4000多出现小头畸形的新生儿，该事件引发全球性的关注，尤其在当时孕妇中造成极大的恐慌。 世界卫生组织宣布该事件列为“全球关注的突发公共卫生事件”。全球的科研工作者投入到该领域的研究，证实Zika病毒（ZIKV）是幕后元凶，而随后针对ZIKV的病毒学、致病病理学等领域都有了许多重要进展。但是对ZIKV如何感染脑部星形胶质细胞（Astroglia），以及病毒进入细胞后如何干扰细胞的生理功能仍然了解不多。

日前，来自德国的研究人员在著名学术期刊Nature上报道了最新的研究成果：利用蛋白质组学分析ZIKV蛋白和寄主细胞的相互作用，鉴定到386个相互作用的蛋白，很多蛋白和neuronal发育、retinal缺陷有关。病毒侵染细胞后常常会影响胞内磷酸化信号转导，同时还分析感染前后磷酸化组学的变化，发现AKT、MAPK-ERK和ATM-ATR信号通路发生变化。

上述结果揭示了很多之前未知的，和ZIKV相关的寄主因子。同时也在磷酸化水平揭示ZIKV对寄主细胞信号的影响，为以后开发相关的治疗方法提供重要的思路。也提示了利用蛋白质组学、磷酸化组学在分析病原微生物和寄主细胞相互作用中的重要性。

研究问题：Zika病毒的寄主因子

技术：蛋白组学，磷酸化组学

期刊：Nature

发表时间：2018.09

研究内容

ZIKV病毒和dengue virus，West Nile virus和hepatitis C virus（HCV）同属于黄病毒（flavivirus），可以通过蚊子传播该病毒。该类病毒是单链RNA病毒，翻译为一个polyprotein，随后加工为3个结构蛋白（capsid、precursor membrane、envelope蛋白）和7个非结构蛋白（图 1）。

为了鉴定和这些病毒蛋白相互作用的寄主蛋白，作者在病毒蛋白末端融合HA标签（图 1），利用亲和层析分离和其相互作用的蛋白，利用蛋白质质谱鉴定出386种与ZIKV蛋白特异性结合的蛋白质，对应484种高可信度相互作用。

图 1 ZIKV翻译为一个polyprotein，加工为10个蛋白产物。研究人员每个外源表达的病毒蛋白都添加了HA标签

已知的和黄病毒flavivirus互作的蛋白如ATPase，voltage-dependent 通道蛋白和细胞色素c氧化酶复合体都包含在本次鉴定的蛋白数据库中。此外和neurological相关的蛋白，尤其是和Capsid和非结构蛋白NS4B互作在本次鉴定的数据库中数量众多（图 2）。

图 2 ZIKV病毒Capsid和众多的寄主细胞蛋白相互作用

为了深入了解ZIKV侵染对神经细胞分化对影响，研究人员首先分析了hNPC（human neural progenitor cell）分化前后的蛋白质变化，结果表明神经元分化的标志物如βIII-微管蛋白(TUBB3)、微管相关蛋白（MAP2、MAP6）、神经元黏附分子（NCAM1）等显著上调（图2a）。过表达 ZIKV-NS4B后， 参与神经元分化的蛋白质(MAP2，MAP6，DPYSL3，DPYSL5和CNTN2)以及与神经疾病相关的蛋白质(DOK3和SUMO2)，显著下调（图3b），暗示病毒侵染干扰了神经元的正常发育过程。同时ZIKV侵染导致I型干扰素刺激的相关基因的上调（如STAT1，MX1，OAS3等）。这些结果表明 ZIKV对分化的hNPCs在蛋白水平的影响。

图3 ZIKV感染神经元细胞后，干扰细胞正常的分化

病毒侵染细胞后常常会影响胞内磷酸化信号转导，因此研究人员分析了ZIKV感染SK-N-BE2 neuroblastoma细胞前后的蛋白质磷酸化修饰的变化。研究人员鉴定到14,222个磷酸化位点（p>0.75），其中1,216个位点的磷酸化水平在ZIKV感染后发生变化。AKT-mTOR信号通路显著下调：如AKT底物DNMT1, TBCAD4和LARP6，mTOR靶标ANKRD17，LARP1，PATL1和EEF2K，以及中枢激酶S6K及其主要效应蛋白S6。除此之外，下调的还有MAPK-ERK信号通路 （图 4）。

图 4 ZIKV病毒侵染细胞后，影响磷酸化信号转导

为了确定新鉴定的宿主因子的功能，作者对ZIKV在不同水平（蛋白丰度、磷酸化水平变化、蛋白互作）影响寄主细胞的因子进行验证。利用shRNA对寄主相关基因进行knockdown，鉴定了17种宿主因子（除了已知的STT3A，MGGT1和MSI1外，其余14种为本研究新发现的），其表达量降低会显著抑制 ZIKV复制。其中(DOK3, XIRP2, YIPF4 and LMOD3)蛋白含量在病毒感染后变化， LMO7, FXR1 and LARP7磷酸化水平在病毒感染后变化，LARP7 、LYAR、BSG and CLN6和病毒蛋白互做发生变化（图 5）。

图 5 利用shRNA下调寄主因子基因，分析对ZIKV复制的影响

总结

本研究揭示了ZIKV侵染寄主细胞过程中的病理变化，不仅在基础研究上有重要的意义，同时对药物研发也意义重大。之前的研究表明，一些化合物对ZIKV有抑制作用，但是具体的机理不明。

本文通过蛋白质组学、磷酸化组学的研究分析ZIKV对寄主细胞的影响，解释了为什么digoxin和fingolimod等化合物在药物筛选中表现一定的效果：digoxin是Na+/K+ ATPase的抑制剂，Fingolimod是sphingosine-1-phospate 受体抑制剂，而该蛋白磷酸化在ZIKV感染过程中下调。

蛋白组学与修饰组学的发展，为病毒学与免疫学的研究提供巨大的助力。在蛋白水平，利用蛋白质组学，分析感病前后蛋白质的变化；在翻译后修饰水平，利用修饰组学关注感病前后蛋白修饰的变化。上述系统生物学水平的研究工具无疑会大大加速我们的研究，提高人们对疾病的应对速度和防御能力。

如Cell Reports报道荷兰乌特勒支大学的研究人员利用高分辨率的蛋白组质谱，分析了7类最常见的人类CD8+T细胞分化前后的蛋白质组变化，揭示病毒刺激CD8+T细胞的分化过程。

Virology曾报道重庆医科大学的研究人员和杭州景杰生物科技有限公司合作，在博尔纳病毒的研究中获得了重大突破，首次得到博尔纳病毒感染条件下人类少突神经胶质细胞的乙酰化修饰组草图，这一发现让人们对博尔纳病毒的感染机理有了更深入的认识。

Nature Immunology杂志报道了曹雪涛院士研究团队的重要研究成果，发现了DNA甲基化酶Dnmt3a能促进天然免疫细胞释放I型干扰素以抵御病毒感染，为有效抗御病毒感染提供了潜在的药物靶点。

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参考文献：

Pietro Scaturro , et al., (2018), An orthogonal proteomic survey uncovers novel Zika virus host factors. Nature.

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