2019-11-21 20:43:23, 季敏标 徕卡显微系统(上海)贸易有限公司
“一花一世界”,这句充满禅意的话在微观视野中得到完美诠释。而构成世间万千纷繁的原子由化学键联合为分子,不同的分子往往具有特异性的化学键振动,成为它们的指纹特征。相干拉曼散射(Coherent Raman Scattering,CRS)显微术便是通过探测目标分子的特征振动来提供成像所需的衬度, 同时基于非线性光学过程大大增强拉曼散射的信号,提高成像速率以及检测灵敏度的新型显微技术[1][2]。
▲水分子的三种振动模式示意
▲图 1.水稻花粉的受激拉曼显微成像图(红:脂质;绿:淀粉;蓝:蛋白)[3]
免标记和分子特异性:CRS 成像的信号来源于目标分子本身,无需外源标记物,也避开了药物小分子等不易标记的问题,在活体(in vivo)观测上更具有优势;可对具有不同拉曼谱的分子进行选择性成像,比如生物样品里常见的脂质、蛋白、核酸和糖类等(如图 1);
较高的探测灵敏度:相比于自发拉曼,成像速度一般有 3-5 个数量级的提升,一定条件下可实现视频成像速度(每秒几十帧);
光学层析和三维扫描:类似多光子显微镜的光学层析和三维成像功能;且由于所用的激发波长一般在近红外,有较好的穿透深度和更小的光毒性。
▲图 2. 自发拉曼散射、受激拉曼散射以及相干反斯托克斯拉曼散射的能级示意图
CARS 与 SRS 虽然都是三阶非线性光学过程,它们之间有明显的区别:CARS 是个四波混频过程,产生的光子具有第三种频率——反斯托克斯光子 ωas,因此只需采用合适的滤波片就可以简单地提取出来;而 SRS 是泵浦和斯托克斯光之间的相互转化过程,泵浦光子的湮灭和斯托克斯光子的产生同时发生,但没有产生第三种光子;因此,通常用泵浦-探测技术中常见的调制解调的方式来提取信号,需要借助锁相放大器来实现。CARS 显微成像技术自 1999 年被发明以来,一直受困于非共振背景信号的干扰,典型的表现为光谱发生畸变(图 3)。在苦苦求索了近 10 年之后,谢教授课题组于 2008 年推出了 SRS 技术,完美地解决了上述问题。CARS 过程中能量被封锁于电磁场/光子中,电子跃迁可绕过分子振动直接通过虚能级产生;而 SRS 的发生依赖于光子能量与分子振动之间的交换,具有严格的共振吸收特征。因此 SRS 在光谱上与自发拉曼一致(图 3),在图像上也不再受非共振背景的困扰(图 4)。此外,SRS 的信号与分子浓度呈线性关系,更方便于定量解析复杂混合物体系中的各种化学成分。也因为这些特性,SRS 不断获得研究者们的青睐。
▲图 3. 视黄醇在 1595cm-1处的 Raman、CARS 与 SRS 的光谱对比 [5]
▲图 4. CARS 与 SRS 对线虫内脂质成像 [6]
综上,CARS 与 SRS 都可以基于生物体中核酸、脂质和蛋白等物质自身的 Amide I、CH2、CH3 等化学键进行特异性成像。由于其免标记、高分辨率、快速成像以及三维扫描的优点,CRS 在病理检测、生物代谢、药物运输等方面具有广泛应用。具体的应用部分将在下一课堂详细讲解。
下面让我们先开启几个 CRS 的成像结果
▲图 5. SRS 对 Hela 细胞中的核酸、蛋白和脂质进行选择性成像 [7]
▲图 6. 小鼠脑肿瘤模型的受激拉曼成像。活体实验中,在(a)肉眼无法分辨肿瘤的区域;(b)受激拉曼技术可以清晰的探测到肿瘤边界;(c)离体鼠脑切片的 SRS 图像。蓝色代表蛋白丰富的肿瘤区域 [8]
▲视频 1.CARS 对皮肤癌囊块的三维层析扫描
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