Flash纯化中，干法和湿法上样，该如何选择？

当我们进行天然产物粗品纯化或者有机合成反应体系纯化时，往往选择对应的上样方式，是直接将样品溶解在溶剂中注入色谱柱中，还是通过硅胶拌样进行干法上样呢？选择不同，分离效果往往也会千差万别。

此篇文章中，我们将结合以往实验室的分离经验，为您展示干法和湿法上样在同一样品上的分离效果比对。

总的来说，湿法上样是目前应用最广泛，使用最简单的上样技术；如果是固体样品，只需将样品直接溶解在溶剂中，然后注入色谱柱中即可完成上样，而如果是液体样品，其上样方式则会更简单，直接将样品注入色谱柱即可，如下图：

Figure 1: 湿法上样图示

它几乎可以满足各式各样的纯化需求，尽管如此，在进行湿法上样的时候，仍然有一些需要我们留意的地方：

• 尽量使用最高的样品浓度，最小的样品体积。当上样体积增大时，样品在色谱柱当中所占用的体积会增大，扩散效应也会明显增强，导致色带变宽，降低分离效率，纯度也随之降低，因此在上样时，应保证最小的体积。

• 请尽量使用最接近于起始流动相极性的溶剂溶解样品，如果极性过大，样品还没有来得及和固定相相互作用，就已经被极性溶剂洗脱下色谱柱，导致保留时间不够，洗脱不充分，分离效率大大降低，从而结果不如预期，如下图：

Figure 2： 某反应体系Flash分离谱图。

此样品使用丙酮溶解，和反应体系相比，丙酮属于大极性溶剂，将粗品100mg溶解在0.4mL丙酮中，使用5 gram, 20 µm Biotage® Sfär HC silica色谱柱进行分离，得到分离谱图如上，可发现即使使用了柱效最高的5gram, 20 µm Biotage^® Sfär HC silica色谱柱分离，并且仅仅上样0.4mL，该粗品的保留时间和峰型都不尽理想，尤其是前90mL的分离，峰型和分离效果严重受大极性溶剂丙酮的影响。

当遇到此类问题时，我们推荐您使用干法上样来代替湿法上样，可解决大极性溶剂带来的分离效果不佳的问题，干法上样支持可以支持多种固定相填料，具体填料类型的选择取决色谱柱填料类型，保证干法拌样的填料和色谱柱固定相填料一致就行；对于Biotage而言，我们为您提供内干法和外干法两种干法上样方式，保证了干法上样的便利性。

当前应用最广泛的当属硅胶填料，您只需将样品和硅胶溶解在特定溶剂中，旋干搅拌均匀后即可进行上样洗脱。固定相硅胶是通过极性分子与硅胶之间的相互作用力的不同而得到了不同的洗脱时间，而得以分离，这一类型的分离更加适合干法上样，往往分离效果也会比湿法更显著。

• 基于相同的吸附原理，往往我们会建议用户使用硅藻土进行干法拌样，硅藻土比二氧化硅具有更少的不可逆吸附和更低的反应活性，可以减少样品损失，提高样品纯度。

随后我们将干法拌样和上文提到的湿法上样进行了实验对比，将硅胶和硅藻土ISOLUTE^® HM-NI两种干法填料同时进行了分离对比实验。

在进行干法上样时，我们将样品和硅胶或者硅藻土以1：4的比例进行溶解混合后，使用Biotage ^® V-10 Touch将样品旋干后都得干法样，随后便转移进全新的DLV干法上样器，如下图：

Figure 3. 全新Biotage DLV 干法上样器

Figure 4, 干法上样分离谱图

在使用相同的纯化方法的情况下，分离结果得到了明显的改善，如图4所示。与湿法上样相比，随着稳定性和分离度的提高，可以清晰的看到峰型的稳定以及出现了8个色谱峰。

另外，上下两个色谱图分别是硅胶拌样和硅藻土拌样的分离谱图对比，从此次实验的图谱来看，两种的干法材料的结果旗鼓相当。

尽管湿法上样简单方便，干法上样相对繁琐一些，但在小分子纯化领域，当您遇到样品峰型不理想的时候，干法上样往往能提高柱效以及样品纯度。