【科普】30000:1 的放大倍数究竟意味着什么？

150 多年来，光学显微镜使用玻璃镜片聚光和放大，从而对肉眼无法看见的显微实体进行观察【1】。目前，光学显微镜有多种类型，但本文主要针对最常用的两种进行说明：数字显微镜【2】，其配备了电子图像传感器，但未配备目镜；以及目测显微镜【3、4】，其配备目镜。此外，目测显微镜还可配备数字照像机，从而具备数字显微镜类似功能。

放大倍数是显微镜按照比例生成比物体实际大小更大（或更小）的图像的能力。使用放大倍数是为了能够在图像中将物体看得更加具体，而不仅仅是使用肉眼观察物体。目前，使用显微镜目镜观察标本图像的放大倍数已有明确限定。国际标准对此具有严格规定，并已记录在案【5-9】。诸多此类标准亦适用于数字显微，数字显微镜大多使用电子监视器观察图像，对数字显微镜放大倍数的严格定义和标准仍有待进一步发展。

数字显微镜以及配备了数字照像机的目测显微镜均能快速采集优质图像。二者多用于不同领域和行业的各类技术应用【10、11】。

放大倍数究竟是什么？放大倍数的基本定义是指，在光学系统中观察到的物体或样品个体特征的大小与物体本身个体特征的实际大小之比。因此，横向放大倍数 MDIS 可定义为：

表达式 1

注意，观察到的视觉放大倍数有效范围主要取决于显微镜系统的最大分辨率。若放大倍数超过有效范围，则无法更具体地观察样品。这种情况被称为无效放大【12、13】。根据最大分辨率，观察距离的有效范围，即光学显示器和观察者肉眼之间的距离，可根据实际情况确定。

使用目测显微镜目镜观察图像时，总体（横向）放大倍数定义如下【8】：

表达式 2

式中：

• MTOTVIS 是指通过目镜观察的总体横向放大倍数；

• MO是指物镜放大倍数；

• q 是指总体镜筒系数（变焦和其他镜筒镜片）；以及

• ME=目镜放大倍数。

检测投影到电子传感器上的显微镜图像时，例如数字照像机的图像，传感器中形成的图像放大倍数如下所示【8】：

表达式 3a

表达式 3b

式中：

• MTOTPROJ是指显微镜的（横向）放大倍数（投影到传感器上的图像）；

• p 是指目镜到照像机之间的投影系数；以及

• MPHOT是指镜筒到照像机之间照相投影透镜的放大倍数。

总体镜筒系数 q 一般在 0.5:1 和 25:1 之间。照相投影透镜放大倍数 MPHOT 一般在 0.32:1 和 1.6:1 之间。

数字显微镜未配备目镜，因此图像投影到数字照像机电子传感器上，并由其进行检测，然后显示在电子监视器上，进行观察。在配备数字照像机的目测显微镜中使用监视器观察图像亦是如此。因此，数字显微的最终总体放大倍数MDIS（表达式 1）取决于监视器的实际像素比。其定义如下：

表达式 4

式中，MDIS是指显示器显示图像的总体横向显示放大倍数，像素比是指照像机与电子监视器显示器之间利用信号传送图像时，图像的“放大”程度。像素大小比例根据监视器的像素大小与照像机传感器的像素大小之比而确定。

表达式 5

此处假设图像按照1比1的像素对应模式从照像机组件显示到监视器中，属于最简单的情况。在这种显示模式中，根据监视器的像素数，监视器中仅能观察到部分图像。

数字显微示例如下图 1：数字显微镜和配备数字照像机的立体显微镜所示。

a）配备 DFC450 数字照像机的Leica M205 C 立体显微镜。通过目镜或电子显示器监视器可观察到蚂蚁样品，使用照像机对图像进行检测。

b）

c）

b) 和 c) Leica DMS1000 数字显微镜利用各种监视器尺寸显示图像

一般说来，光学仪器的分辨率是具体观察图像的能力。具体的说，分辨率是辨别物体图像紧密排列的相邻点或相邻线的能力。通常，不论采用哪种分辨率定义，两种术语的使用意义都相同。显微镜中，分线率以线对/毫米表示。也就是说，黑白线对及其厚度和线距均可在一定的分辨率下辨别。

放大倍数大但分辨率不足会导致无效放大，如上所述【12、13】。因此，必须了解分辨率的限制因素，不仅包括数字显微，还包括所有类型的光学显微。

徕卡纤维系统制造的所有显微镜数字照像机中使用的传感器，一般情况下，像素数均在 1,600 x 1,200 到 4,080 x 3,072 之间，像素大小在 2 到 6.5μm 之间（示例见表 1）。高清（HD）计算机监视器或电视的像素为 1,920 x 1,200 或 1,080，像素大小在 0.1 到 0.9mm 之间（示例见表 2）【14、15】。因此，监视器像素一般是照像机像素的 25 到 450 倍。

表 1：Leica DFC450 和 MC120/170 高清照像机和 Leica DMS300/1000 数字显微镜使用的图像传感器规格

表 2：高清电子监视器显示器示例：计算机监视器或电视

了解了照像机传感器的一般像素大小（表 1）和高清平板监视器的一般像素大小（表 2），即可利用表达式 5（表3）计算出大小比值。

表 3：高清监控器（表 2）与Leica DMS1000/DMS300 数字显微镜、以及Leica MC170/MC120 高清照像机和DFC450数字照像机（表 1）的像素大小比例（表达式 5）

为简单起见，本报告仅探讨 2 个数字显微示例，即数字显微镜和配备数字照像机的立体显微镜。假设，使用1比1照像机-监控器像素对应，将图像投影到高清监控器上，大小范围在 21.5”（对角线尺寸为 21.5 英寸【1365px】）到7”（对角线尺寸 74.5英寸【4725px】）之间。2 个示例分别是数字显微镜 Leica DMS1000 以及安装了C-mount 的Leica MC170 高清数字照像机的立体显微镜 Leica M205 A。表 4 说明了配备 MC 170 高清照像机的 Leica DMS1000 或M205 A 能够达到的总体放大倍数值示例。Leica DMS1000 的物镜放大倍数范围在 0.32x 到 2x 之间，镜筒系数（q）包括照相投影透镜，其范围为 8.4:1。配备 MC170 高清照像机的 Leica M205 A，其物镜放大倍数范围在 0.5x 至 2x 之间，变焦范围在 0.78x 至 16x 之间，目镜放大倍数范围在 10x 至 25x 之间，C-mount 透镜放大倍数范围在 0.4x 至 1x 之间。

表 4：Leica DMS1000 数字显微镜以及配备 Leica MC170 高清数字照像机的 Leica M205 A 立体显微镜的总体放大倍数数据MTOT VIS和MDIS（表达式 2 和表达式 4）。探讨的高清监控器大小（表 2）和像素比（表 3）可能适用的最大和最小放大倍数值范围。

监控器总体横向显示放大倍数达到30,000:1 需要多大的像素呢？如下示例采用配备 MC170 高清照像机的 Leica M205 A 以及表达式 3b、表达式 4 和表达式 5。M205 A 在照像机传感器上投影的样品图像的最大放大倍数为：

像素比值对应总体放大倍数30,000:1，其在传感器上的放大倍数为32x，其值为：

Leica MC170 高清照像机传感器的像素大小为 2.35μm。使用上述像素比值 938:1，且照像机-监控器像素1比1对应，监控器像素大小应为：

因此，为使 LeicaM205 A和 MC170 高清数字照像机的总体放大倍数达到 30,000:1，监控器像素大小应为 2.2mm。这一像素大小对应的高清监控器对角线为 4.9m。

现在，肯定有人会问，30,000:1 的放大倍数是否超过了有效范围，成了无效放大？使用监控器观察图像时，我们应该如何确定数字显微放大倍数的有效范围呢？首先必须深入了解显微镜系统分辨率以及观察距离。

数字显微镜（或配备数字照像机的立体显微镜）系统分辨率主要由 3 个因素决定：

• 光学分辨率：

表达式 6

式中，NA 是指数值孔径，λ 是指光的波长，单位为 nm；

• 图像传感器（照像机传感器）分辨率：

式中，MTOT PROJ是指样品在传感器上的放大倍数（表达式 3），“传感器像素合并模式”是指像素合并模式，1 表示全帧，2 表示 2x 2像素合并，以此类推（参见图 2），“像素大小”是指传感器像素大小，单位为µm；以及

• 图像显示器（监控器）分辨率：

式中，MDIS是指总体横向放大倍数（表达式 4），监控器像素大小单位为 mm。

照像机传感器和显示器监控器分辨极限是根据处理数字信号的奈奎斯特频率或采样频率定理而确定（参见图 2）【16】。该定理假设分辨 1 个线对至少需要 2 个像素。本报告中，如上所述，最佳案例是假设传感器像素和监控器像素 1 比1 对应。因此，使用表达式 4，将监控器像素大小转化成以µm 为单位，从而明确传感器和监控器分线率限值一致。

数字显微镜系统分辨极限根据上述 3 个分辨率值的最小值而确定。

a）

b）

图 2a-b：a）照像机传感器检测图像的像素合并模式示例：无合并（全帧 1x1）、双重合并（2x2）、三重合并（3x3）、四重合并（4x4），以及b）照像机传感器检测黑/白线对的像素合并模式示例，其用于测量显微镜的分辨极限，每个线对（奈奎斯特频率）至少需要2 个像素（红色方块）。但是，如果每个线对使用 3 个或 3个以上像素，则图像效果会更好。

观察距离是指观察者肉眼和显示图像之间的距离。观察距离的有效范围由显微镜系统分辨率和观察者的分辨视角确定【17】。一般情况下，标准人眼的分辨视角为 2.3 至 4.6 弧分。也就是说，监控器间距与特定观察距离角度相差 2.3 至 4.6 弧分的情况下，人眼能够分辨监控器上的具体细节。观察距离的有效范围表达式如下所示：

式中，MDIS是指总体横向放大倍数（表达式 4），“系统分辨率”是指上述显微镜分辨极限。

本文的探讨内容假设观察距离在有效范围内。

为了解如何确定数字显微放大倍数的有效范围，即在显示器监控器上观察放大的图像，首先需要简要说明目测物体图像观察到的放大倍数。利用几何光学，可以获得下列表达式：

式中，MDIS是指总体放大倍数（表达式1），250 是指观察距离的标准参照，单位为 mm，其根据人眼的平均近点确定。

现在，放大倍数的有效范围可以结合表达式 9 和表达式 10 进行最终确定：

因此，放大倍数的有效范围为显微镜系统分辨率的 1/6 到 1/3 之间。

• 高倍放大

新式照像机传感器的像素大小范围在 1-6µm 之间，远低于 10µm。使用传感器高倍放大样品时，例如：150:1，且无像素合并，传感器和监控器像素1比1对应，则根据上述表达式 6、表达式 7 和表达式 8，可以得出，显微镜系统分辨率根据光学分辨极限进行确定。最大数值孔径接近 1.3，可见光的最小波长约为 400 nm，则光学分辨极限为 5,400 线对/mm。同等条件下，像素大小低于 10 μm 的照像机传感器，其分辨极限很容易超出这一数值。具体案例条件下，根据上述表达式 11，数值有效范围内最大放大倍数为 1,800x。

• 低倍放大
  

使用照像机传感器中以小于等于 1x的放大倍数低倍放大样品时，数值孔径一般低于 0.03.照像机传感器的像素大小越大于 2 微米，其分辨极限越低于此类低倍放大的光学分辨率。因此，以小于等于 1x 的放大倍数低倍放大时，传感器或监控器分辨极限更可能成为显微镜系统分辨率的主导因素。

• 无效放大

此处探讨的数字显微是假设始终在上述有效的观察距离范围内观察监控器图像。只要观察到的放大倍数值超过有效放大倍数范围，即 1,800x，则无法更具体地分辨样品。

物场（OF）是最终图像中产生的物体组成部分。也称作显微镜视场（FOV）。因此，某一物体的具体细节只有在物场中呈现出来，才能进行观察。

通过目镜进行观察时，物场呈现的是部分样品的可见圆形图像。物场大小（参见表达式 12）根据目镜视场直径（FN）以及物镜和镜筒透镜（参见图 3）的放大倍数而确定。

数字显微的物场由于接收图像的图像传感器和显示图像的监控器二者的性质而呈现为长方形（参见图 3）。其宽度和高度单位为毫米。数字显微应注意光学系统创建的图像大小要足以覆盖整个图像传感器。在这种情况下，应根据显示像素的数量、高度、宽度及其实际大小（像素间距），考量显示区域的实际大小。

为计算物场，传感器显示区域的实际大小（参见表达式 13）应根据物镜、镜筒以及照像机投影透镜的放大倍数（MTOT PROJ）或监控器的总体横向显示放大倍数MDIS进行划分。根据各高度和宽度中较小的数值确定数字显微镜的物场。

物场的高度和宽度无需由图像传感器或显示器一同进行限制。例如，高度可由显示器进行限制，但宽度可由传感器进行限制。最终物场将根据图像传感器和显示器的尺寸和纵横比以及二者显示图像的像素对应（1:1、1:2、2:1 等）进行确定。本报告中，假设传感器像素与监控器像素1比1对应。

目镜物场根据下列表达式进行确定：

表达式 12

式中：

• OF目镜是指通过目镜观察到的物场；

• FN 是指目镜视场直径；以及

• MO× q（参见表达式 2）是指目镜根据物镜、变焦以及目镜前其他镜筒透镜而做出的总体放大倍数。

图像传感器的物场可利用传感器的宽度和高度进行确定，根据在传感器上生成样品图像的光学器件的总体放大倍数进行划分：

式中：

• w 是指传感器观察到的物场宽度；

• h 是指传感器观察到的物场高度；

• MTOTPROJ 是指样品在传感器上的总体放大倍数（表达式 3b）；以及

• 像素大小单位为 μm。

就同一样品而言，通过目镜观察到的图像与照像机组件记录的图像之间的物场差异、物镜以及变焦设置如下列图 3 和图 4 所示。图 4 中，物镜和变焦透镜的总体放大倍数为 1x，但放大倍数不同的几类 Leica C-Mount 多会安装 Leica DFC450 照像机，其2/3 组件位于 Leica M205 A 立体显微镜上。图 4 的红色长方形表示图 4b 中采用 0.32x C-mount 的图像物场。蓝色长方形表示图 4c 中采用 0.5x C-mount 的图像物场。绿色长方形表示图 4d 中采用 0.63x C-mount 的图像物场。图 4b 表示光晕问题，即图像边缘与中心相比较暗。为避免此类问题，一般情况下，建议采用 0.32x C-mount 时，使用组件大小为 1/3''（8.45mm）的数字照像机；采用0.4x C-mount时，使用组件大小为1/2.3''（11mm）的数字照像机；采用0.5x C-mount时，使用组件大小为1/2''（12.7mm）的数字照像机；采用0.63x C-mount时，使用组件大小为 2/3''（16.9mm）的数字照像机。

a）

b）

图 3：示意图直接对比徕卡显微系统的目镜（白色圆形）观察到的图像以及数字照像机组件（长方形）同时观察到的图像。示例 2 表明：a）视场直径（FN）为 20mm 且配备C-mount 0.4x 透镜的目镜；以及b）视场直径为 23mm且配备C-mount 0.5x 透镜的目镜。某些照像机检测图像以纵横比 4:3（红色长方形）的格式存储数据，以纵横比 16:9（绿色长方形）的格式输出即时图像。

a）利用视场直径为 23mm 的 10x 目镜进行拍摄，并使用配备 Leica C-mount（MPHOT）的 Leica DFC450 数字照像机进行记录

b)0.32x MPHOT，且物场为27.2×20.3 mm

c）0.5x MPHOT，且物场为17.4×13 mm

d）0.63x MPHOT，且物场为13.8 × 10.3 mm

图 4：Leica M205 A 立体显微镜观察到的西门子星形图像，该显微镜物镜和变焦透镜的总体放大倍数（MO × q）为 1x。第 1 个黑色线圈直径为 10mm，第 2 个黑色线圈直径为 20mm（参见 4a 和 4b）。4a 中的红色长方形表示 4b 的物场（0.32x C-mount），蓝色长方形表示 4c 的物场（0.5x C-mount），绿色长方形表示 4d 的物场（0.63x C-mount）。

照像机传感器的物场（OF）可利用上述表达式 13 进行计算。Leica DMS1000和配备 MD170 高清照像机的 Leica M205 A 的物场数值范围如表 5 所示。同样，Leica DMS1000 的放大倍数范围为：物镜 0.32x 至 2x，镜筒系数（q）（包括照相投影透镜）比例为 8.4:1,；配备 MD170 高清照像机的 Leica M205 A的放大倍数范围为：物镜0.5x 至 2x，变焦0.78x 至 16x，C-mount 0.4x 至 1x。

表 5：Leica DMS1000 数字显微镜和配备MC170 高清数字照像机的 Leica M205 A立体显微镜观察到的图像物场（OF）数据（表达式 13）表示了最大和最小数值范围。

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