【干货】显微镜课堂：微分干涉相衬观察法 (DIC)

微分干涉相衬观察法 (DIC) 显微镜检查是明场显微镜检查的明智之选，利用这种先进的技术手段可以观察到未染色的试样，而这些试样在明场中成像较弱。

利用偏振光观察浮雕样成像

未染色试样通常并不显眼，在明场显微镜检查中几乎看不到试样的细节。但实际上，这些试样会与穿过它们的光源发生作用，并产生相移，而这些现象肉眼是看不见的。染色会导致振幅偏移，且穿过的光线强度会存在差异，但绝大多数情况下，无生命的试样才会发生上述现象。DIC 显微镜检查是一种利用光程长度的梯度差和相移，令相位物体在光学显微镜下清晰可见的技术手段。用户可以利用这种方式，通过适当的相衬度和分辨率来观察活细胞和有机体。

DIC 显微镜产生的图像为浮雕状，看起来有投影。这些图像没有光晕现象，相对其他显微镜而言，由于具备光学切片功能，即使较厚的试样也依然能够成像。

在 DIC 显微镜检查中，只有偏振光可用于试样照明。上述偏振光通过偏光正交平面，被色散成两条不同的光射线。这两条光射线彼此非常接近。由于这两条光射线在试样中会发生折射或散射，因此，会产生不同的相移。如果这些光射线重新聚合，它们会互相干涉。光线此时为椭圆偏光。该偏光将通过检偏镜转变成振幅移位。通过这种方式，令高达 1/200 波长（使用照相机时，甚至达 1/1000 波长）之间波长差的相位移动，以及整个波长都清晰可见。

图 1a：变形杆菌，DIC

图 1b：变形杆菌，明场

光波振荡

在非偏振光中，光波会在光传播轴的各个方向上振荡。但是，在线性偏振光束中，所有光波的振荡均有相同的角度或偏光面。圆形偏光是偏振光的另一种存在形式。光波振荡呈旋转式移动，且绝对值稳定，但是，方向会随着恒角速度的变化而变化。椭圆偏光是线性和圆形偏光的组合。

产生偏振光的设备称为偏光镜。用于确定振荡平面的类似部件被称为检偏镜。偏光镜具有吸附性和光束分裂性的特征。

图 2：偏振光。线性偏光部件（红色和灰色）线性、圆形或椭圆形偏振光波（黑色）构成

DIC 显微镜中的光路

在 DIC 显微镜中，聚光镜前面的偏光镜会发出偏振光。该偏振光将被分成两条线性偏振光射线，通过 DIC 棱镜（亦称作 Wollaston 棱镜）构成偏光垂直面。聚光镜平面上装有 Wollaston 棱镜。 标准的 Wollaston 棱镜由双折射材料制成的两个楔体构成，这两个楔体在其基座上相互贴合，其光轴与外表面平行，且互相垂直。

图 3：在 Wollaston 棱镜前半部分，一条 45° 偏振光被分成两条垂直的偏振光射线，角度分别为 0° 和 90° （左图）。在 Wollaston 棱镜后半部分，将根据偏振光依次改变光分散（右图）。两条光射线穿过聚光镜之后，互相平行。

穿过上述棱镜的偏振光被剪切成两条互相接近的光波，具有不同的偏转角，分别为正常波和异常波。它们具有相互垂直的偏光面，针对上述两条光波，中波用于检验其是否存在单独的有效折射率。干涉面会发生波阵面的切变，其位于两个棱镜的折射接合处。光波在空间上由剪切角进行分离。对于穿过整个棱镜的所有匹配光波来说，这些光波的方向和互相之间的距离是相同的。两条光波之间的空间必须小于显微镜分辨率极限。

因此，两个互相接近的光波对将会照亮试样，其与横向位移平行。如果上述两条光波与试样相互作用，而试样每个部分的折射率或厚度各不相同，此时，当光波从试样射出时，其光程长度会存在差异。折射率乘以光路上两点之间的厚度，即算出光程长度。它与传输时间和光速相关。由于光程长度与光的传输时间相关，两条匹配的光波之间会发生相位移。

光波穿过试样之后，穿过另一个 Wollaston 棱镜，然后重新聚集在一起。现在，这些光波将互相干扰，构成椭圆偏光。上述椭圆偏光将穿过检偏镜。仅带有清晰偏光面的光源能够穿过，因此，针对不同光波会产生不同的振幅。相移将转变成振幅移位，会导致生成图像中出现不同的光强度。

现代化 DIC 显微镜中，Wollaston 棱镜常常被更改。Nomarski 棱镜就是一个经过更改的示例。它含有两个双折射光楔，但其中一个楔体与 Wollaston 棱镜相同。另一个楔体则是经过更改的，其光轴被倾斜放置。这会导致干涉面伸出棱镜之外。因此，棱镜可以放在物镜光阑面之外，这样，使用起来比较方便。

在 DIC 显微镜检查中，相邻物点的相移差有助于成像。用户可以看到折射率或厚度存在梯度差的试样细节。由于光束的偏光彼此垂直，通过旋转显微镜载物台可以获得不同的图像。

记住不要使用 DIC 显微镜检查中的塑胶这一点非常重要，因为很多聚合物对光源具有消偏振效应，会妨碍相衬效果。

图 4：从光源产生的非偏振光穿过偏振滤光片，并在 45°角度产生偏光。当光线穿过 Wollaston 棱镜后，被分离成垂直偏光组分，分别呈 0°和 90°偏光。随后，聚光镜引导光线穿过试样。该试样由两条不同偏光的相干平行光射线照亮。这样，基本上就产生了试样的两个存在稍微位移的明场图像，一个是 0°偏光，一个是 90°偏光。 由于偏振光不同，这些图像不会互相干扰。由于分离的光射线在穿过试样时，试样的厚度和折射率存在差异，因此这些光射线也会产生不同的光程长度。这样会导致其中一条光射线相较另一条光射线产生相移。穿过物镜后，垂直偏振光将在 135°角度上与一条偏振光重新组合。根据光程长度的差异，两条光射线的干扰会产生变亮、变黑的现象，从而使原本几乎看不见的结构显现出来。最后，未出现任何相移的直接透射光，将在 135°方向上通过偏振滤光片（亦称作“检偏镜”）被清除。

图 5a：小鼠成纤维细胞，DIC

图 5b：紫露草属，DIC

图 5c：微星鼓藻，DIC

图 6a-c：C. 通过微分干涉相衬（DIC）和带有不同分束角的 Wollaston 棱镜进行的线虫记录

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