海光科普 | 砷元素形态分析样品前处理技术

01

概述

砷元素的形态与毒理学关系息息相关，砷元素形态分析作为最重要的元素形态技术受到普遍关注。元素形态分析技术主要由样品采集、样品制备、分离/富集、定性/定量、分析报告等五部分组成。由于一砷元素存在几十种元素形态，且不同的元素形态间在一定的条件下会相互转化，因此元素形态的分析方法已不同于传统的总量分析。在前处理方法上需要保持元素的现有形态，因此也不能沿用传统的用于总量分析的酸消解方法和灰化法，对样品前处理方法提出了更高的要求。

在整个形态分析过程中，样品制备过程是形态分析的关键环节，直接与分析结果的有效性息息相关。因此在样品制备过程中需要注意保持待测元素形态，同时避免污染，这使得样品制备过程较常规总量分析更加复杂和困难。因此，对操作人员提出了更高的要求，同时也延长了前处理时间。

砷元素形态样品前处理技术中，需要考虑样品的特点，如样品基体(是否存在氧化剂或还原剂)、脂肪及蛋白含量、溶液状态的pH、微生物、活性酶等要素。

样品及提取液的储存容器，需要考虑长期稳定性及吸附和转化的特性，优选聚四氟乙烯、聚乙烯和石英等材料。储存条件需要考虑环境温湿度、光照、微生物以及是否需要保护剂等因素。

固体样品的通用前处理方法包括液氮低温干燥或冷冻干燥、粉碎、过筛、杀菌处理、低温避光保存、处理前含水量校准以及后续的称取、提取、浓缩、稀释、定容、流动相匹配等。液体样品的通用前处理方法包括移取、提取、浓缩、富集、定容、过滤、离心和流动相匹配等。

样品的提取方法主要包括恒温水浴法、微波辅助提取、超声波辅助提取、加速溶剂萃取、蒸馏、固相微萃取以及酶解等。

选择样品提取方法的原则包括元素形态的提取率，提取过程中对元素形态变化的控制，提取时间和效率，提取方法的可操作性，提取试剂的环保性，提取方法的安全性，成本控制以及推广普及的可行性等。

常用的提取试剂包括甲醇水、三氟乙酸、磷酸、盐酸、碱性溶液、正己烷/苯/甲苯等、吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(APDC)、二乙基二硫代氨基甲酸盐(DDTC)、2-巯基乙醇、L-半胱氨酸、Tris－HCl缓冲液、离子液体以及活性酶等。

02

砷元素形态分析样品前处理示例

2.1  螃蟹罐头和海藻样品中无机砷

称取0.5g样品，置聚丙烯离心管中，加入10ml 2mol/L TFA溶液，密闭，在80℃恒温箱中保温2h（每半小时后振摇1 min），取出冷却后，8000r/min离心15min，取上清液。在残渣中加入10ml超纯水，摇1min，4000r/min离心15min，取上清液。在残渣中加入超纯水，按上述过程重复两次（尽可能清洗残渣）。合并上清液，置玻璃旋转蒸发瓶中。

含脂肪的样品（如螃蟹罐头）经上述操作后，合并的上清液置玻璃离心管中，加入25ml正己烷，振摇1min后，4000r/min离心15min，弃去上层溶液。按此过程重复一次。使用长颈吸管（巴斯德滴管）小心吸取下层溶液，置玻璃旋转蒸发瓶中。

将提取液在60℃减压下旋转蒸发至尽干，分三次各加入5ml超纯水，再旋转蒸发至尽干（尽可能除去提取液中TFA残留）。残渣中再加入超纯水，多次洗涤，并转移至10ml刻度试管中，以超纯水稀释至刻度，经0.22μm水相滤膜过滤后测定。

2.2  市售的鱼、虾和贝类样品中砷甜菜碱（AsB)、亚砷酸盐(As（III）)、砷酸盐(As（V）)、二甲基砷酸（DMA）和一甲基砷酸（MMA）

取海产品的可食用部分，匀浆后，冷冻干燥。

称取样品0.5g，置50ml聚丙烯离心管中，加入10ml甲醇/水 (9：1，v/v)溶液，超声振荡10min，4000r/min离心15min，取上清液。残渣按此过程再重复提取4次，合并上清液于50ml离心管。以N₂吹至尽干，加入10ml超纯水，再加入10ml正己烷，振摇1min，以4000r/min离心15min，取下层溶液，以超纯水定容至10ml，经0.22μm尼龙膜过滤后测定。

2.3  鱼肉组织中砷甜菜碱（AsB）

精确称量(0.1～0.3)g 样品,置于装有滤纸与聚四氟乙烯(PTFE) 线的11ml 不锈钢萃取池中。萃取条件：仪器：Dionex ASE 200；预热时间：2 min；加热时间：5 min；萃取时间：5 ×2 min；温度：100 ℃；压力：1500 psi；溶剂：甲醇。萃取液经0.45μm有机相滤膜过滤后测定。

2.4  海产品中砷甜菜碱(AsB)

将所得到的试样（除盐、酱油等）压在两片滤纸之间，切成小块，于-20℃下冰冻；然后冻干20h。将冻干试样粉碎，并用水冷碾机匀化成细粉。

称取冻干试样2.00g于50ml带盖子的离心管中，加入40ml甲醇/水（1：1，v/v），在振荡器上振荡15min。在2000r/min离心10min后，收集提取液。提取过程进行三次。

将冻干试样的甲醇-水提取液蒸发（T=55℃）至尽干，重新溶解在25ml 0.1mol/L HCl中，并用4mol/L HCl调节pH在(1.8±0.2)之间。酸化溶液通过强阳离子交换剂（Dowex 50W-X8），用25ml试剂级水洗柱，被吸附的AsB用75ml 4mol/LNH₃.H₂O洗出。将洗出液蒸发至干，干渣重新溶解于3ml超纯水中，溶液经0.45μM过滤器过滤后测定。

2.5  紫菜样品中无机砷

精确称取0.5g粉碎后紫菜样品于15ml离心管中，加入10ml甲醇/水（1：1，v/v）溶液，振荡均匀后，超声萃取 20min，3000rpm/min离心 10min，取出上清液；重复上述萃取过程3次，合并各次上清液到100ml烧杯中。合并液在60℃下蒸至约5ml，冷却后用水稀释并定容至10 ml。萃取液在10000rpm/min条件下离心10 min，上清液经0.45μm滤膜过滤后测定。

2.6  紫菜样品中砷形态

称取2. 0 g 市售紫菜干品, 剪成小块于烧杯中, 加入50 mL 纯水, 用粉碎机捣碎1 min , 使样品均匀分散于溶液中, 转入离心管, 置于离心机中以3 000r /min旋转10 min 后, 上层液用5A 滤纸过滤, 再用孔径分别为1、0. 2μm滤膜微滤, 最后超滤除掉相对分子质量10 000 以上的物质, 滤液用5 %(φ) 甲醇稀释10 倍, 即为待测样液。

2.7  鱿鱼丝中砷的形态（As(III)、As(V)、DMA、MMA、AsB、AsC）

对于高蛋白的样品，甲醇对其砷形态特别是AsB的提取效率较高。因此本实验以甲醇/水（1：1，v/v）、甲醇为提取剂，采用超声波辅助萃取和ASE这两种前处理方法对鱿鱼丝的砷形态进行提取。

  ① 快速溶剂萃取

准确称取0.5g鱿鱼丝样品于不锈钢萃取池中。萃取程序如下：萃取时间：2min×5；萃取温度：100℃；萃取溶剂：甲醇；萃取压力：1500psi。萃取液在40℃水浴中旋转蒸干，残渣用超纯水溶解，定容至25g，溶液经0.45μm滤膜过滤后测定。  

② 超声溶剂萃取

准确称取0.2g鱿鱼丝样品于离心管中，加入5ml甲醇/水（1：1，v/v）超声45min，然后置于离心机中以5000r/min旋转30min。小心移出上清液于100ml圆底烧瓶中。重复上述步骤三次。合并提取液并于40℃水浴中旋转蒸干，所剩残渣用超纯水溶解，定容至25g，溶液经0.45μm滤膜过滤后测定。

③ 盐酸浸提

准确称取1.25g鱿鱼丝样品于15ml具塞刻度离心管中，加HCl(1＋1)10ml，混匀，置于60℃水浴锅中18h，期间多次振摇，使试样充分浸提。冷却，过滤。取2ml滤液于5ml容量瓶中，调节pH 至7.0左右，用超纯水定容，测定。

2.8  海藻样品中砷形态（As（III）、As（V）、DMA、MMA、AsS）

用超纯水清洗样品几次，去除盐类和小的无脊椎动物后，海藻样品转移到聚乙烯袋子中，立即在-25℃条件下冷冻储存。样品在实验室中重新解冻，在烘箱中60℃条件下烘干，用ZM 100离心不锈钢研磨机研磨成粉末。 

称取1g干的海藻样品于50ml塑料离心管中，加入甲醇/水 (1：1，v/v) 50ml。振荡样品2min充分混合，用带有温控的超声波在30℃条件下超声3h。在3600rpm/min下离心30min分离上清液和残留物。收集上清液，经0.45μm和0.2μm尼龙注射器过滤后测定。

2.9  海藻、鱼或贝类样品中砷形态（As（III）、As（V）、DMA、AsS、AsB）

 称取0.5g（干重）海藻样品和5g（湿重）鲜鱼或贝类的肉样品放于不锈钢研磨机中研磨。样品放入离心管中，加入10ml 甲醇/水(1：1,v/v）混合物。样品超声10min后离心10min。萃取物被移入一个圆底的烧瓶中。每个样品重复萃取4次。合并萃取物，萃取物在30℃下旋转蒸发至尽干，用10ml去离子水溶解。溶液经0.45μm水系滤膜过滤后测定。

2.10  牡蛎组织样品砷形态分析（阴离子砷形态和阳离子砷形态）

称取干燥的牡蛎组织等分试样0.1mg于50ml带有螺帽的聚乙烯管中。加入20ml甲醇/水( 9:1,v/v）混合液。密闭并拧紧聚乙烯管，放入十字形的旋转装置上， 以45rev/ min上下翻转14h，混合物以2500 rev/min离心15min。上清液转移到250ml圆底烧瓶中。离心管中的残渣用20ml甲醇/水(9:1,v/v）润洗三次，混合物离心，上清液又被转移到圆底烧瓶中。合并的上清液在室温、真空条件下，旋转蒸发至尽干。蒸发后的残渣用水定容至100g。萃取液用0.22μm Millex-GS 纤维脂滤膜过滤后测定。

2.11  酒和海藻类样品中砷形态（As（III）、MMA、DMA和As(V)）

称取0.5g海藻粉末试样，于15ml离心管中，加入5ml甲醇/水（ 1:1，v/v) 混合溶液，在室温下离心20min。重复一次，合并提取液，提取液蒸发至干，用去离子水定容至一定体积。溶液经0.45μm的水系膜过滤后测定。

酒样品用纯水稀释(1:1)后，直接测定。

2.12   啤酒样品中砷形态分析（As（III）、MMA、DMA和As(V)）

啤酒样品直接测定。

2.13  鱼肉组织中砷形态分析（AsB和DMA）

① 称取1g样品，加入20ml甲醇/水（1：1，v/v)，超声提取，重复提取三次，合并萃取液并蒸至尽干，用水稀释并定容，样品经0.45μm滤膜过滤后测定。

② 称取1g样品，加入20ml甲醇/水（1：1，v/v)，机械搅拌提取，重复提取三次，合并萃取液并蒸至尽干，用10 ml水稀释定容，样品经0.45μm滤膜过滤后测定。

③ 称取1g样品，加入10ml甲醇/水（1：1，v/v)，超声提取，重复提取5次，合并萃取液并蒸至尽干，用水稀释并定容，样品经0.45μm滤膜过滤后测定。

④ 称取1g样品，加入20ml甲醇/水（3：1，v/v)，超声提取，重复提取5次，合并萃取液并蒸至尽干，用20 ml水稀释定容，样品经0.45μm滤膜过滤后测定。

⑤ 称取0.5g样品，加入0.1g 胰岛素和15ml碳酸氢铵（buffering at pH8）, 在37℃条件下机械搅拌4h，调节pH 至7.0左右，用水定容，样品经0.45μm滤膜过滤后测定。 

⑥ 称取1g样品，加入15 ml水，在20W条件下微波辅助萃取10min，萃取液经0.45μm滤膜过滤后测定。

    ⑦ 称取0.15g样品，加入2.8ml甲醇/甲烷（5：2，v/v），超声萃取4次，用水反萃取，萃取液经0.45μm滤膜过滤后测定。

2.14  大米样品中砷形态（As（III）、As(V)、MMA和DMA）

称取粉末样品（0.25-1）g 加入（2-3）ml 2mol/L TFA溶液。混合物放置于60ml带盖的HDPE离心管中，在100℃条件下放置6h。TFA萃取物中用DIW稀释到刻度，离心混合物，上清液经0.45μm过滤后测定。

2.15  婴儿食品中砷形态

称取0.5g 婴儿食品试样，与100mg胰朊酶和5ml 0.1mol/L碳酸氢铵溶液一起置于匀化器中，用涂有PTFE的研杵将混合物匀化，然后温和地研磨至少3min，再将研匀后的试样放置在50ml聚乙烯管中，加盖，并在37℃下振荡过夜。冷却后，将试样定量转移至25ml容量瓶中，并用0.1mol/L碳酸氢铵溶液稀释至刻度。调节pH 至7.0左右，过滤后测定。

2.16  萝卜样品中砷形态（As（III）、As(V)、MMA和DMA）

萝卜样品用塑料刷子在水流下刷洗，去掉根部和坏的部位，用水冲洗，干燥。剁碎萝卜样品，冷冻，磨碎后通过40目筛子。

称取1g样品和4g扩散剂混合，样品通过ASE系统萃取，萃取程序如下：溶剂：水，压力：1500psi，静态萃取时间：1min，萃取次数：3次，加热时间：5min ，萃取温度：100℃，冲洗：100%，冲洗时间：90s，样品重量：(0.25-1.25)g。对于低于1.25g的萝卜样品来说，最优的扩散溶剂是酸洗的Ottawa沙子。样品经0.45μm尼龙或玻璃过滤器过滤后测定。

2.17  土壤/沉积物中砷的形态提取

在土壤样品中，As(V)一般是其中的主要成分，而As(III)相对较少，约占总As的1/3。在土壤中，As的迁移量仅占总As含量的0.04%。有机胂（单甲基胂和二甲基胂）仅在污泥中被发现，其浓度在0.3ng/g左右。

用于土壤中As的提取剂有：酸性浸取剂（pH2-3）、碱性浸取剂（pH10-11）和有机酸浸取液（如乙酸、柠檬酸、草酸等）。

① 沉积物中As(III)和As(V) 

称取1.0g试样于50ml聚乙烯离心管中（带盖），加入40ml盐酸羟胺溶液（0.4mol/L），加热至95℃,8h，间歇振荡。提取完成后，将试样离心10min(10000r/min)，然后用移液器分出悬浮液，调节pH 为7.0左右，溶液经0.45μm 的水系膜过滤后测定。

②沉积物、土壤、泥渣中As(III)、As(V)、MMA、DMA

称取(0.15-0.3)g干固体试样引入分解管中，其中盛有(25-50)ml提取液（0.3mol/LH₃PO₄），微波辐射（40W）20min。冷却后，所得混合液转移至一离心管中，在3400r/min下离心20min后，悬浮液移至(50-100)ml容器中，调节pH 为7.0左右，溶液通过0.2μm膜过滤器过滤，检测。

③沉积物中As(III)、As(V)、MMA、DMA

以NH₃.H₂O/NH₄Cl(0.4mol/L)为提取液，置于盛有40ml含有一定量试样的离心管中，加热至95℃，振荡8h；然后，离心10min(10000r/min)；分析前，将提取液稀释4倍，调节pH 为7.0左右，过滤后测定。

④沉积物中可溶态As

试样平均粒径＜25µm，称取(50-350)mg试样于带盖的Teflon瓶（15ml）中，加入10ml 0.75mol/L HNO3，半胱氨酸（0.04%）和Triton X-100(0.005%)。在微波场下，用50%功率处理30s，全功率90s；然后，在超声浴中（60-70℃) 振荡12min。测量前，剧烈振荡30s。调节溶液pH 为7.0左右，过滤后测定。

2.18  土壤和沉积物试样中砷形态（As(III)、As(V)、MMA、DMA）

将0.15g或0.3g固体试样于盛有25ml或50ml磷酸提取液的分解管中，放入微波炉，在40W下照射20min。冷却后，所得混合物转移至离心管中。在3400r/min下离心20min，取上清液调节pH 为7.0左右，用去离子水稀释至50ml或100ml。过滤 (0.2μm) 后测定。

注：以上样品前处理方法来自文献。

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