使用UNIFI科学信息系统对包装材料提取物进行非靶向筛查分析

随着全球法规的不断增加，对各个行业中的包装材料进行表征变得越来越重要。制造商需要评估包装材料中的添加剂和其他成分可能向最终产品中发生的迁移，因为可提取物和浸出物可能会对患者的健康产生影响。医药行业中的可提取物是指在受控的实验条件下能够从包装材料或装置中提取出的化合物。化妆品行业最近加入到要求对包装材料进行检测的行业之列。欧洲化妆品行业的最新法规（欧盟法规1223/2009）附件1中规定“有关包装材料的信息、杂质、痕量元素必须测定”。在化妆品行业中，浸出物的影响将取决于应用的途径。例如，浸出物对应用于皮肤的化妆品（如护肤霜）的影响程度不及对可能摄入或透过皮肤吸收的产品（如口红或睫毛膏）的影响程度大。

对包装材料的可提取物进行表征的初始步骤包括靶向筛查，即，检测已知化合物的提取物。这是一个非常成熟的分析流程，可采用包括GC-FID-MS和LC-UV/MS在内的各种分析技术。然而，最终包装材料中可能含有源自原材料和其他降解剂（例如，在模塑工艺中形成的那些降解剂）的杂质。确保这些化合物不会对消费者产生毒理学风险的第一步是鉴别可提取物，或至少鉴别其结构类别。未知物的结构解析通常是一个非常复杂且耗时的过程，需要分析人员具备较高的专业知识水平。Waters UNIFI科学信息系统利用精确质量数和碎片信息，简化了数据审查并有利于制定决策。它使分析人员能够更高效地对复杂数据进行评估，并快速确定未知化合物中可能的成分。

结果与讨论

通常，使用通用梯度LC-MS方法进行包装材料提取物的筛查实验。由于不清楚提取物的色谱图可能属于哪种类型，因此在研发的这一初始阶段无法针对各种包装材料对筛查方法进行优化。如果色谱图中仅有一个或两个色谱峰，那么分析人员很容易确定研究的起点。然而，如果提取物具有多个未完全分离的色谱峰，或者必须对多组样品进行比较，则分析人员需要确定该提取物独有的且不存在于提取空白中的化合物（图1）。此外，离子化强度较低的化合物或毒理学关注的痕量化合物可能在总离子流（TIC）色谱图上或者甚至在基峰强度（BPI）色谱图上都无法分辨。

图1. 包装材料提取物和空白提取物的质谱图。

二元比较

在仅需要比较两个样品的情况下，例如空白提取物（参比）和样品（未知），UNIFI软件的二元比较功能使分析人员能够直接比较分析物样品与参比样品的色谱和质谱结果。如果参比谱图和未知谱图中的质量数（m/z）处于用户指定的质量数、保留时间和强度差异容差以内，则认为它们是同一组分。比较结果可以用图表形式显示为BPI或TIC色谱图的镜像图片，也可显示为候选质量数表格（图2）。候选质量数为原始数据中具有相同峰特征的精确质量数和保留时间对。按保留时间的匹配度和同位素间距对其进行分组。

图2. IPA参比样品提取物与口红包装材料样品之间的二元比较结果窗口。红色迹线显示了参比样品（IPA空白提取物）的BPI色谱图；蓝色迹线显示了口红包装材料提取物的BPI色谱图；而绿色迹线则显示了两个样品之间的差异。

UNIFI显示了未知样品与参比样品中化合物的质谱图比较结果，并展示了两者的差异。图2显示了IPA空白提取物“参比样品”与口红包装材料提取物“未知样品”之间的比较结果，其中“匹配类型”列中突出显示了候选质量数是仅存在于未知样品或参比样品中还是同时存在于两个样品中，其对应的匹配类型分别为“未知样品独有”、“参比样品独有”或“共有”。在本例中，最值得进一步评估的将是那些不存在于提取空白（未知样品独有）中的候选质量数。

由于仪器灵敏度很高且LC-MS溶剂、提取容器、塑料移液枪头等普遍存在许多可提取物，因此通常很难获得纯净的空白。

当未知样品中的候选质量数强度远高于参比样品时，其对于评估化合物很有用。标记为“未知/参比”的列（图2）显示了共有组分的比值，使用户能够快速识别可能持续性存在但有明显倍数变化的共有提取物。对于候选质量数m/z 553.4595而言，其响应比值超过3000，表明该候选物可能存在于提取空白中或残留中。

高分辨率质谱能够提供非常全面的高质量信息，但手动解读数据集可能较为困难。因此，数据处理软件对于更高效地管理和审查数据至关重要。UNIFI软件使用户能够设置工作流程，以便用最有效的方式显示数据，并且仅显示相关的数据，所有操作只需轻点鼠标即可实现。然后，可根据用户自定义的标准对处理后的数据进行筛选。在本例中，为便于管理表格中的信息，根据未知样品独有的候选质量数强度计数高于10000且共有候选质量数的未知样品/参比样品响应比值至少为300的标准对数据进行筛选。

一旦数据以最有利于分析人员的方式组织好后，下一步将是利用精确质量数信息和高碰撞能量碎片信息对目标候选质量数(例如，强度最高的候选质量数)进行解析。

多变量分析（MVA）

二元比较适用于比较两个样品，但需要比较多个样品或样品组时，使用多变量统计分析工具（如，主成分分析PCA）将有利于鉴别样品或样品组之间的差异。UNIFI可以根据用户自定义的条件生成标记点矩阵，然后自动传输到EZInfo 3.0.3中进行多变量分析。PCA是一种统计分析工具，能够将庞大的多变量数据集约简为不相关的变量，即主成分。如果需要在研究的样品组中进行额外的区分，则可以采用“投影潜在结构判别分析”（PLS-DA）模式重点分析差异（图3）。PLS-DA模拟了所有样品组的变量X（预测）和Y（响应）之间的定量关系。然而，在此类图中，每个样品由一个点表示，这就无法观察到对组间差异有影响的单个标记点。

图3. 所有包装材料样品组的PLS-DA模型。

为了在单个标记点水平上考察组间差异，可使用载荷图。载荷图展示了X变量彼此的关联性，距离中心越远的数据点表明样品组之间的差异越大（图4）。这些图中的数据点称作精确质量数/保留时间（AMRT）对。载荷图中的象限与PLS-DA模型相对应，因此左下方象限的AMRT表示口红包装材料中独有的标记点。以红色方框选中的标记点对口红包装材料与所有其他包装材料样品之间的差异贡献最大。组间差异可能来自其中一组中不存在的分析物，或来自组间强度（浓度）变化最大的分析物。

选中代表口红包装材料与其他样品组之间最大差异的各个标记点（在图4中以红色突出显示），并将其传输回UNIFI的发现工具进行解析。传输载荷图中的选定标记点时，可添加标记以便对数据进行排序和跟踪不同样品组的标记点（图5）。在标记点矩阵表中选中单个标记点时，将显示趋势图，使用户能够快速评估其是否存在于其他样品或进样中。

图4. 所有包装材料样品的载荷图。

图5. 带标记的标记点的标记点矩阵与RT 6.34 min处的标记点553.4589所对应的趋势图。

发现工具

无论采用二元比较还是多变量分析，在获得标记点或目标候选质量数后，工作流程的下一步都是结构解析。UNIFI解析工具集中的发现工具包括自动元素组成计算、通过ChemSpider或UNIFI的可配置科学谱库进行数据库检索，以及单个或批量候选质量数的高碰撞能量数据的碎片匹配。根据识别出的高能量碎片数量、ChemSpider的引用数和质量数准确度显示最佳匹配结果。元素组成算法使用精确质量数和同位素信息计算各个标记点可能的组成。使用开发工具设置，分析人员可指定同位素匹配的可接受水平（i-FIT）、元素组成搜索中应包含的元素、选用的ChemSpider谱库（全部或特定谱库）以及ChemSpider中的最少引用数等。

睫毛膏包装材料中的候选质量数m/z 360.3236的最终结果显示在表格中，其中列出了指定限制条件下的元素组成、可能的结构及其在ChemSpider数据库中的引用数以及各种结构与高碰撞能量数据匹配的碎片数量（图6）。

图6. 利用UNIFI发现工具得到的睫毛膏包装材料中RT 4.18处的m/z 360.3236的解析结果。

许多聚合物添加剂在LC-MS分析过程中会形成加合离子（最常见的是Na+）。加合离子的强度可能高于质子化物质，或者可能完全不存在质子化离子。在本例中，使用+H离子对质量数进行初始评估时未得到合理的分子式（不存在50%以上的i-FIT并且ChemSpider中无匹配结构）。因此，选择Na+作为加合物，重新采用开发工具进行解析。如图7所示，分子式C22H43NO具有100%的i-FIT，意味着m/z的同位素比与推荐的组成相一致。ChemSpider返回该分子式对应的多个可能的结构匹配结果。

按照引用数排序时，可以看到首选结构在高能量数据中也具有最多的可能碎片匹配数量之一。另外，由ChemSpider搜索返回的常用名称有助于分析人员确定正确的结构。许多聚合物添加剂具有诸如Irganox''s或Tinuvin''s等常用名称，其比起化学名称更容易识别。元素组成为C22H43NO且引用次数最多的化合物有多个常用名称，说明其为聚合物添加剂（例如，Armoslip）。对该化合物的成分进行进一步研究，发现它是芥酸酰胺，一种在包装材料中常用作滑爽剂的脂肪酸衍生物。

结论

在未经优化的LC-MS分析中对组分谱图进行表征可能很复杂，因此使用自动化软件工具有利于快速评估候选质量数可能对应的结构。本文所述的LC-MS和信息学工作流程采用高分辨率质谱，可用于化妆品、食品和药品包装材料可提取物的分析。在单一软件平台上利用有关精确质量数母离子和碎片离子信息的MSE数据，可简化鉴定和审查过程。

基于信息学的结构解析发现工具可通过对可能的元素组成进行排序并随后在数据库中搜索可能的结构(根据碎片匹配度确定优先次序)，快速评估未知m/z的信息。UNIFI软件工作流程可轻松对重要标记点进行排序，有利于鉴别组分。