“2016乳制品检测会”精华总结帖,你错过了几百亿!

2019-02-20 09:21:28 沃特世科技(上海)有限公司


撒花!撒花!

由《实验与分析》品牌主办,沃特世公司协办的“2016乳制品鉴别检测技术交流会”于上周四(24号),在沃特世北京培训教室落下帷幕。  

谢谢到场嘉宾和听众的大力参与!你们的满意是我们最大的动力!

小析姐深知,乳制品检测领域小伙伴队伍壮大,能来现场的小伙伴都很幸运,但多得是临时有事或者在异地来不了现场的小伙伴们,小析姐没有忘记你们,这不,精华总结帖出炉啦!

乳制品检测技术,要学、要做的还有很多,在此,小析姐答应你们,如果大家有需要,咱们会义不容辞走出北京,造福其他城市小伙伴哈!

废话不多说,进入正题!

本次乳制品鉴别检测技术交流会,是以“羊奶粉鉴别和定量检测技术”为主题的。很多人不知道,所谓的羊奶粉掺假,定义并不准确,容易引起歧义,奶粉掺假一般是指以次充好、添加豆粉、各种添加剂等,但我们对于羊奶粉“掺假”鉴别主要是检测羊奶粉是否加入了过量的牛乳清蛋白(国家有规定表示一定量内的牛乳清蛋白添加不算掺假)。在目前国标缺失的情况下,如何对羊奶粉中牛、羊乳清蛋白进行鉴别并定量分析?这种“牛”“羊”混合的非纯羊奶粉现象是否正常?一起来回顾任一平教授的精彩演讲!


羊奶及其制品鉴别与定量检测技术(质谱法)——任一平教授


产奶粉合格率高于海淘奶粉

任老师在一开场就呼吁大家,一定要相信国产奶粉的质量,不要认为国外的奶粉一定比国产好,他强调,其团队对大量国产奶粉样品进行检测,合格率可达70%左右,而在对多个海淘奶粉样品的检测中,发现合格率仅有30%左右,大量的例证让在场听众唏嘘不已。这的确和大家原来的想象有差异。

针对本次演讲内容,首先任教授介绍了羊奶的需求与追溯,羊奶相比牛奶有多种优势,导致羊奶粉市场需求量越来越大,寻找一种有效的检测羊奶粉是否“掺假”的技术手段势在必行。要知道,国家在允许在羊奶粉中加入牛乳清粉,但必须在包装上标明添加的量,但国家目前没有相关定量的国标方法。因此,任老师介绍说,自己和其团队近两年在做的研究正是关于牛、羊乳清蛋白的鉴别与定量检测技术相关。

有3种检测方法都有缺陷

任教授对目前现有的几种检测方法做了有不同程度的评价:

PCR 法:从奶中残留体细胞提取DNA,体细胞数量与奶牛健康状况密切相关作为定性检测方法,PCR方法本身无法准确定量检测。

ELISA 法:假阳性;牛/山羊奶序列同源性较大;无法检测变性蛋白。

液相色谱/电泳/蛋白质谱扫描:蛋白质理化性质非常接近,难以达到完全分离;方法有一定缺陷。

于质谱技术的蛋白质组学

随后,任老师提到基于质谱技术的蛋白质组学:之前所使用单四级杆的ESI源对蛋白的检测,选择多电荷离子进行定量,但面临的问题是,无法对经热加工变性蛋白进行检测。

现在的最新方法的大致流程为:使用高分辨质谱得到质谱图,使用蛋白组学软件,根据已知蛋白数据库,利用PLGS软件比对数据库,得到相应的蛋白结果,再建立低分辨质谱方法,得到理想的结果。

到牛、羊蛋白的特异肽很重要

他强调:“我们关注,蛋白被切后酶切割后,针对得到的特异肽段进行筛选,肽的序列是什么?有什么规律?我们现在方法是蛋白加内标,质谱必须是同位素内标,最准确,分子式一样,质量数有区别。蛋白经过烷基化,把蛋白的立体结构打开,即把具有三级结构的蛋白质→破坏三级结构→舒展的蛋白质→酶解→肽段→UPLC‐TOF分析。

简单来说,就是得到的肽数据,根据序列找到特异蛋白的肽段,成为特异肽,三重四级杆定量准备,找到母、子离子,使用MRM的检测方式,得到目标谱图。

要注意:肽母离子扫描会形成多电荷,分子量越大,多电荷越多,找到蛋白的特异肽很重要,这里,他提到同位素的合成和设计相对来说成本较高,但能得到理想的结果。

通过一系列检测找出同一个蛋白,因为羊和牛的特异肽段,两者有区别,所以,以上介绍方法适用于各种配方粉。



谓的特异肽段筛选原则
所谓的特异肽段筛选的原则:找到目标蛋白质:四种酪蛋白+两种乳清蛋白。
•  特异性:通过特异肽段可区分牛羊乳之间的差异(分别6个肽段,牛和羊共12个同位素);
•  通用性:适用于山羊奶与绵羊奶;适用于各种配方乳粉及其原料。
此外,任老师介绍了一直以来,其研究团队所做的:特异肽标准品图、山羊鲜奶色谱图、

纯牛全脂粉样品谱图、奶牛鲜奶色谱图、加入牛乳清的配方粉样品图谱、纯山羊全脂粉样品谱图、加入牛乳粉的配方粉样品图谱,如下图。








要继续完善的工作

最后,任老师表示,目前关于保障乳制品安全方面,还有很多工作要做,所列需要继续完善的工作如下:1.进一步完善本方法,建立统一、实用的检测方法规程,在实际应用中检验,并不断完善;2.对我国的羊奶主产区进行代表性的取样检测,积累有关乳清蛋白、酪蛋白的数据;3. 根据所得数据,应用统计数学模型建立检测数据的计算方法;4. 研制牛、羊单独或混合的乳粉标准物质,统一、可量值索源的标准品。5.细化对羊乳的的鉴别,山羊与绵羊制品之间的鉴别与定量,建立陕西山羊奶的特异性数据库。6.继续扩大方法的适用范围,包括其他动物奶源的检测定量(水牛奶、牦牛奶等)。



任老师提到国标方面,他认为值得欣慰的是,2014年12月国家通过,新乳清蛋白的检测方法国标,这可以说是是食品安全法向前进的一个大发展。最后,他建议相关羊奶企业,要建立羊奶原料检测的一些方法,严把质量关,这也是当务之急。
乳制品中维生素测定的解决方案——陈静


沃特世应用方案解决中心应用工程师陈静主要介绍了乳制品中水溶性维生素和脂溶性维生素测定的两个实际解决方案:ACQUITY Arc + QDa 测定婴幼儿奶粉中的水溶性维生素;2D中心切割技术测定奶粉中的脂溶性维生素ADE。
11
种水溶性维生素一针进样,同时测定
陈工介绍说,现有国家标准中的水溶性维生素检测方法:主要是液相色谱及微生物鉴定法;为了满足不同的分析条件,经常需要对各种维生素进行单独分析,这通常需耗费大量时间和成本。在此背景下,沃特世基于质谱检测器更好的选择性和灵敏度,可以让样品制备方案更加简单,开发了一种同时分析婴幼儿奶粉中多种水溶性维生素的质谱检测方法。ACQUITY Arc液相系统分离,QDa质谱检测器检测,11种水溶性维生素一针进样,同时测定。




新LC-MS技术,让“鱼”和“熊掌”兼得成为可能
让小析姐印象深刻的是,沃特世全新LC-MS技术,让“鱼”和“熊掌”兼得成为可能!Arc系统把ACQUITY 家族延伸到同时使用HPLC和UHPLC(亚3µm填料)分离方法的实验室。你知道吗?在常规分析中,系统可按照指定的pH和离子强度来准备流动相;在方法验证中,成为测试方法耐受性的强有力的工具;在方法开发中,可以解决手工配制导致pH值有差异的缓冲液。


身板,大能耐
她重点介绍了QDa质谱检测器,用来同时测定多种水溶性维生素,其优异选择性和灵敏度可以让样品处理方法更加简单,只需要对样品提取物进行稀释即可进行检测,极大的降低了测试水溶性维生素的方法难度。
沃特世QDa质谱设计上颠覆传统“质谱仪”的概念,看起来相当迷你,普通检测器大小,与色谱系统自由配置;一键开启,半小时即可进行定量测定;使用完毕即可关机,无需长期保持真空状态,30-1250 M/Z质量范围,10000da/s扫描速度;维护简单,无需特殊学习,看过即会使用。
“UPLC
 2D系统”遇上“脂溶性维生素”
陈工介绍说,沃特世UPLC 2D系统中心切割法可同时测定婴幼儿奶粉中的维生素A,维生素E和维生素D的方法,方法重现性高,定量准确,二维谱图基线分离维生素D2/D3,并且可以满足国标中奶粉测定A、D、E的限量要求。


从谱图可以得出结论:9分钟内完成两个维度的分离,峰形尖锐对称,灵敏度高;8针重现性良好(一维重现性非常好,峰不漂移,确保切割准确);此外,她还强调:2D UPLC技术与三重四极杆的联用,是“复杂基质中痕量化合物检测”的利器。
牛奶中β- 内酰胺类抗生素及酶抑制剂+婴幼儿奶粉中叶黄素的测定——冯峰


高效液相色谱法测定婴幼儿奶粉中的叶黄素
冯峰博士首先介绍了婴幼儿奶粉中的叶黄素的初步测定解决方案,可参考 GB/T 23209- - 2008  《奶粉中叶黄素的测定  液相色谱--紫外检测法》。但他强调,经过检测样品后发现,国标GB/T 23209-2008 中所规定的前处理方法其实不能将样品处理干净,并且很有可能导致色谱柱污染,从而使色谱柱柱效显著降低,特别伤不起!


取回收率较高的前处理方法
冯博介绍,经查阅相关资料,选取可行性较高的两种前处理方法进行验证:液液萃取、SPE固相萃取法。分别进行优化后进行检测结果对比选取回收率较高的前处理方法,结果显示如下图。


C18
和C30色谱柱行比对实验
实验表明,C18色谱柱和C30色谱柱在对色黄素的分离效果有相当大差异(不同流动相):C18色谱柱对黄素有一定的分离效果,而在C30色谱柱上,叶黄素在1个小时后也无法得到洗脱。




柱温的选择进行探讨

冯博强调,柱温的选择并不是温度越高越好,当柱温由25 ℃增加到35℃和45 ℃时,可以观察到叶黄素后面的一个干扰峰已经逐渐和叶黄素的峰发生融合,这将会对检测产生一定干扰。

随后,冯博也用同样步骤,参考 GB/T 18246- - 2000 《饲料中氨基酸的测定》 ,以及相关国内外文献参考资料,对婴幼儿奶粉中的色氨酸初步测定进行了介绍。检测结果表明,这十一种市售的国内外婴幼儿食品中色氨酸的添加量在1.82~3.35 mg/g范围内 。
LC
-MS/MS测定牛奶中β-内酰胺类抗生素及其酶抑制剂
冯博士解释,关于β-内酰胺类抗生素及其酶抑制剂,牛奶基质中同时检测的LC-MS/MS方法尚无文献报道。针对内酰胺类抗生素及其酶抑制剂,因为都是大分子,所以不能使用小分子检测方法,关于两类物质是否可以同时检测,他认为,要看分子式、结构式和是否可以同时处理,比较厚发现有可行性。醋酸铅是被选择的前处理方法,如下图。




冯博士认为,此方法相对简单,关于方法的评价:主要是看其线性关系,定量限和检出限,对方法进行方法评价,则要看其回收率和精密度,最后一步是对方法的应用。
奶制品及其原料中农、兽残筛查解决方案——张婷婷


找更具成本效益的定性方法用于筛查
沃特世食品环境市场部应用工程师张婷婷主要介绍使用Waters多残留筛查的完整解决方案。谈到目前实验室分析现状,张婷婷认为,实验室分析的目标物数量在不断地增加、需要配制包含大量目标物的标准品溶液、配制基质匹配的标准品校准曲线,然而,通常只有一部分农药会经常检出(<100),所以一个更具成本效益的定性方法用于筛查是必需的,最好用定性方法筛查到特定的目标物后,再采用经验证的MRM方法去定量。
报告中从前处理方案的选择到如何运用液相色谱质谱联用系统有效的进行多残留高通量的筛查和阳性确证工作,都给予了分析思路。


LC
MSMS残留分析中液相色谱的分离很重要
张工随后介绍了Waters四极杆质谱配合Quanpedia 数据库解决目标多残留筛查难题的方案,以Oasis PRiME HLB-UPLC-MS/MS测定牛奶中72种兽药残留为例,案例分享中展示了从样品前处理,到调用库中方法采集、处理数据,再到阳性结果确证的分析流程。此外,还要强调的是,辅助评定基质干扰的Radar功能与色谱分离结合对结果准确性大有影响。


Waters LC-MS/MS多残留分析方案针对GB2673-2014的农残以及动物源食品中100多种常见兽残的建立了液质筛查方法。整个样品分析过程简单、快速,结合Waters仪器特有的Pics确证功能和数据库检索使筛查结果更加可信。


什么要用高分辨质谱进行筛查?
高分辨质谱已然成为食品领域的筛查工具,可以实现对大量的化合物的筛查工作;不同于串联四极杆的筛查方式, 高分辨质谱可实现非目标物筛查,无需预先设定化合物范围,无需对化合物进行专门的调谐;可实现完整的谱图分析;更多更准的化合物信息:精确分子量、碎片离子、同位素分布、加合离子、离子比

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