沃方案 | 采用DESI质谱成像了解动植物分子特征

2019-02-20 09:17:24, Waters 沃特世科技（上海）有限公司

近年来，一种原位电离技术——解吸电喷雾电离（Desorption Electrospray Ionization，DESI）越来越多地应用于质谱成像。它可以在大气压环境下直接分析样品的表面，而无需进行任何样品前处理操作。

沃特世解吸电喷雾电离（DESI）技术

人和动物组织样本分析

我们采用DESI来成像分析人体和动物的组织样本。由于DESI可以采用足够低的雾化气压力和溶剂流速，因此相同的组织样品可以重复分析而不会损耗样品表面的信号。这样，我们可以从单一组织上获得尽可能多的分子信息，以及随后用于组织病理学的分析。

实验方法

样品配置

人体和动物组织样本在冷冻切片机上以15μm厚度进行冰冻切片，切片置于玻璃载片上-80℃冰箱存储。分析前，将样品恢复至室温即可，而无需任何别的处理。

实验条件

DESI和SYNAPT HDMS G2-Si，采用90%甲醇作为喷雾溶剂，流速1.5μL/min，雾化气N2的压力为100psi，喷雾电压为5kV，空间分辨率为50～200μm。

数据处理软件为高清成像软件（High Definition Imaging，HDI）。

图1：DESI成像实验的工作流程

实验结果

在同一组织切片上进行正、负离子的DESI

成像实验

实验的目的是评估DESI采集模式的切换是否会改变同一组织上获取的化学信号。

图2比较了连续三次DESI成像实验中（正离子→负离子→正离子），两张正离子模式下采集得到的质谱图，可以观察到它们具有类似强度的信号。

图2：动物样本同一区域上正离子信号下采集的质谱图

A）原始的样品第一次的正离子质谱信号

B）一次完整负离子成像实验后，二次采集正离子质谱信号

DESI这种再次分析样品的能力不仅可以获得更为丰富的质谱信息，而且对于珍贵的样品来说，如临床人体组织样品，也是至关重要的。

图3即展示了这样一个例子，采用正、负离子的DESI成像分析人体组织样品。可以看到在正常组织和肿瘤组织上分别鉴定了一些特征的脂质信号。由于DESI分析并没有使样本发生根本改变，后续的表面分析技术和染色技术（如H&E染色）可以在同一组织切片上进行，以病理学的角度再次精确地理解和描述所分析的组织。

图3：DESI成像分析人体组织样本（单个组织切片上包含正常组织和二级肿瘤组织）不同组织上可识别信号强度差异明显的特征脂质，从而以分子结构水平来定义不同的组织形态

在同一组织切片上进行不同空间分辨率的DESI

成像实验

首先，在一个动物组织样本和一个人体组织样本上，分别以150μm和200μm的空间分辨率进行DESI成像的数据采集。然后，再分别以50μm的空间分辨率在同一组织上的特定区域进行DESI成像实验。A所示为这组实验的工作流程。

图4：A）使用不同空间分辨率多次DESI成像实验的工作流程

B）动物组织样品上单个150μm像素点的质谱图

C）再次分析同一动物组织样品上单个50μm像素点的质谱图

图5列举了一个动物组织切片上提取离子的质谱成像图。A和B分别代表了不同空间分辨率下（150μm和50μm）采集的m/z为927.7的磷脂酰甘油（Phosphotidyl-glycerol，PG）的信号。C和D是红色/绿色离子的叠加图，分别代表了m/z为848.55的磷脂酰胆碱（38：4）（Phosphotidyl Choline，PC，红色）和m/z为927.7的PG（绿色）的质谱成像图。显而易见的是，更空间低分辨率采集的谱图质量改善明显。

图5：动物组织切片上提取离子的质谱成像图

另一个DESI成像实验是关于人体组织样本，包含正常组织和二级肿瘤组织。先以200μm空间分辨率采集一个完整的质谱成像图，然后对感兴趣的区域做进一步的分析。图6所示200μm空间分辨率下采集到的脂质信号，其中m/z为771.52的PG（36：3）（红色）和m/z为750.55的PE（O-38：5）（绿色）可用于区分不同组织类型。

对健康区域做了进一步的分析（50μm），得到更为清晰的图像。观察到肿瘤细胞可能已经渗透到健康组织。随后的H&E染色也用于精确表征组织的不同区域。

图6：人体组织样本负离子模式下DESI成像分析，H&E染色

A）200μm空间分辨率下从原始样品表面采集两个脂质叠加信号

B）200μm空间分辨率下正常组织的局部放大图

C）50μm空间分辨率再次分析正常组织上感兴趣的区域

D）两次DESI成像实验后进行H&E染色获得的切片图

实验结论

优化的喷雾压力和溶剂流速可以最小化样品表面的信号衰减，使DESI可以在同一组织上依次进行多次成像分析，如正、负离子的信号，不同空间分辨率的信号采集。

DESI可以从样品表面获取丰富的代谢物和脂质信号，可完美兼容组织病理学的工作流程；从分子和化合物结构水平上重新认识您的样品。

植物叶和花的分子特征分析

自然界中，那些令人难以置信美丽的花和叶代表了他们巨大的化学复杂性，植物叶和花的大小，形状和化学特征的差异揭示了潜在的遗传结构和他们与环境的相互作用。

这里，我们采用解吸电喷雾电离质谱（DESI-MS）来了解这些脆弱的植物表面的分子特征。结果，由DESI-MS采集并构建的数据库很好地证实了植物的种类。同时，DESI-MS也提示了其它研究的可能性，如确定物种的差异，有毒产物的演变过程，生长过程中代谢产物的变化，害虫/病原体的攻击等。以及部分细微结构成像的可行性，如花瓣、叶泡、叶缘和叶脉的分子特征。

实验方法

新鲜的植物样本取下后，采用少量有机溶剂去除植物表面的蜡质层（视情况而定），然后再采用双面胶固定于玻璃载片上，供DESI成像分析。(图1)

图1：用于DESI分析的植物样品处理的一般流程

实验结果

DESI成像质谱图与ESI-MS质谱图的对比

这里，选用了一个模型植物，马达加斯加长春花（Catharanthus roseus（L.）G. Don），采用DESI-MS来分析花瓣和叶片表面的代谢产物，并将结果与其提取物的电喷雾电离质谱（ESI-MS）相比较。结果两种电离方式获得的质谱图基本一致，而DESI的优势在于样品几乎不需要做前处理。

图2：长春花花瓣和叶片中代谢产物的分布

A）（a）长春花花瓣的ESI MS谱图。（b）长春花花瓣的DESI成像实验时，其中一个像素点（20×20μm）的质谱图

B）与上述采样方式一致的，长春花叶片的质谱图

DESI成像分析植物生长过程中代谢产物的变化

为了确定不同生长阶段代谢产物的改变，采用DESI成像依次分析了幼苗期和衰老期的长春花叶片（图3）。据文献报道，叶片中的主要代谢产物之一，Vindoline，主要分布在植物的地上部分，且成熟期以后含量就不再增加了。DESI质谱图验证了这一结论。还发现在幼苗期的叶片中优势信号主要为m/z 339，而在成熟期的叶片中优势信号变为m/z 337和m/z 457。

图3:长春花叶片中优势代谢产物的DESI质谱图

A）幼苗期

B）衰老期

成像分析代谢产物在植物生长阶段的变化对于农业和粮食作物的影响深远。一些需要监测的有毒代谢产物可能会出现在植物生长的早期阶段（例如，马铃薯、番茄等茄科植物含有的一类天然毒性的糖苷生物碱）或成熟阶段（如在烟草中、烟碱向回转化为去甲基烟碱时，会形成致癌前体N -亚硝基去甲烟碱）。尽管糖苷生物碱的毒性是众所周知的，但它们的生物活性，尤其是抗癌活性，却是可取的。植物部位中糖苷生物碱的含量是变化，特别是在叶片下的代谢变化更为突出，因此必须在作物生长的不同阶段监测这类生物碱的含量。

图4，A显示成像技术可以用来快速识别幼苗期的土豆叶片中两个关键的糖苷生物碱，α-solanine 和α-chaconine。 B则显示了成熟期的番茄叶中典型的配糖生物碱α-tomatine（m/z 1034.7和528.9）的分布。