Texas A&M University周育斌/王天禄团队JACS论文：AI从头设计咖啡因诱导蛋白解离系统

化学诱导邻近（Chemically Induced Proximity，CIP）系统能够利用小分子控制蛋白质之间的相互作用，已成为合成生物学和细胞工程的重要工具。相比之下，化学诱导解离（Chemically Disrupted Proximity，CDP）系统通过小分子触发已有蛋白复合物解离，从而终止特定生物过程，在细胞治疗安全控制、基因表达调节和信号通路干预等方面具有独特优势。然而，目前可用的CDP工具数量有限，部分系统存在可逆性差、诱导剂价格高或生物安全性不足等问题。因此，开发具有良好安全性、快速响应能力和临床转化潜力的新型CDP系统，已成为该领域的重要研究方向。

针对这一问题，Texas A&M University周育斌等团队在此前构建的咖啡因响应模块COSMO基础上，开发了一种基于咖啡因的小分子诱导蛋白解离系统——CODS（Caffeine-Operated Dissociation System），实现了蛋白相互作用的快速、可逆解离调控。近日，该项研究成果发表在化学领域顶级期刊之一Journal of American Chemical Society上【1】。

该研究团队此前开发了一种咖啡因响应模块COSMO，该模块能够在咖啡因存在时发生可逆同源二聚化。基于这一特性，研究人员提出了一种化学诱导解离系统（图1.A）。在无咖啡因条件下，COSMO与从头设计的结合蛋白形成稳定复合物；而当加入咖啡因后，COSMO优先发生同源二聚化竞争性占据原有结合界面，从而促使结合蛋白释放，实现蛋白复合物的快速解离。

图1：CODS系统设计原理与开发流程。(A) 咖啡因诱导COSMO同源二聚化，通过竞争性界面占位促使从头设计结合物解离。(B) 基于质膜共定位分析的结合物筛选与咖啡因响应验证策略。(C) 结合BindCraft设计、结构预测和分子动力学模拟的结合物发现与优化流程。

基于这一设计思想，研究人员首先建立了一套基于人工智能的从头结合物发现流程（图1.C）。研究人员利用BindCraft平台，直接以COSMO的二聚化界面作为靶点模板，通过序列生成与结构预测，获得了13个候选结合蛋白。随后，研究人员构建了基于质膜共定位的活细胞筛选体系（图1B），直接评估候选蛋白与COSMO的结合能力及其对咖啡因的响应特性。通过这一策略，研究人员成功鉴定出候选蛋白B3（图2.A）。进一步的分子动力学模拟表明，B3与COSMO能够形成稳定的结合界面，其构象波动和界面能量波动均低于其他候选蛋白，表明该复合物具有更好的结构稳定性。为了进一步提高结合性能，研究人员结合Rosetta能量计算对B3进行了计算机辅助突变扫描。通过分析不同突变对蛋白稳定性和结合自由能的影响，最终筛选出R44V突变体（图2.B）。实验验证表明，该突变显著增强了B3与COSMO的结合能力，同时仍保持良好的咖啡因响应特性。

基于优化后的结合体，研究人员构建了两种CODS系统（图2.C）。其中CODS1采用COSMO与B3(R44V)组合，而CODS2则采用双价化的biCOSMO-L与B3(R44V)组合。性能测试显示，两种系统均具有极高的咖啡因敏感性，EC50分别为86.9 nM和25.5 nM，远低于人体正常饮用咖啡后血液中的咖啡因浓度（图2.D）。同时，系统表现出优异的可逆性，其解离和重新结合半衰期约为2分钟，可在多轮咖啡因添加和洗脱过程中稳定运行。

图2： (A) COSMO（浅蓝）与B3（蓝）复合物预测结构。COSMO同源二聚化界面（绿），接触咖啡因结合残基（紫红）。(B) B3单点突变的计算机模拟能量变化图。(C) CODS1（分子间二聚）与CODS2（分子内二聚）解离机制示意图。(D) CODS1与CODS2的咖啡因剂量-反应曲线。

在完成系统构建后，研究团队进一步验证了CODS在基因表达调控中的应用潜力。他们将CODS2与经典TetR转录调控系统结合，构建了一个由咖啡因控制的转录关闭模块（图3）。在无咖啡因条件下，转录激活因子能够被募集到目标启动子区域，从而驱动下游基因表达。当加入咖啡因后，CODS2介导的蛋白复合物发生解离，转录激活因子被释放，目标基因表达随之终止。实验结果表明，咖啡因处理可使报告基因表达水平下降超过20倍。进一步的循环添加与洗脱实验显示，该调控过程具有良好的可逆性，说明CODS能够实现对外源基因表达的动态控制。

图3：(A) 咖啡因作为抑制剂的转录重编程系统示意图。无咖啡因时转录开启，报告基因（荧光素酶或分泌型碱性磷酸酶SEAP）组成型激活；加入咖啡因破坏CODS2相互作用，终止基因转录。(B) 有无咖啡因（100 nM）处理下，HEK293T细胞中CODS2-tTA诱导的荧光素酶表达定量。(C) 恒定或循环咖啡因处理下HEK293T细胞SEAP分泌定量。

随后，研究人员探索了CODS在程序性细胞死亡调控中的应用。在天然生理状态下，细胞焦亡主要依赖于炎性Caspase剪切并活化执行蛋白Gasdermin D（GSDMD）（图4.A）。如图4.A-D所示，研究团队将焦亡执行蛋白Gasdermin D（GSDMD）的N端和C端分别连接CODS1模块，使两部分在无咖啡因状态下保持结合并维持失活状态。当加入咖啡因后，CODS1介导的相互作用被破坏，GSDMD活化并形成膜孔，引发细胞焦亡。实验观察到明显的乳酸脱氢酶释放以及典型焦亡形态变化，证明CODS能够作为一种可控的细胞死亡启动开关。

研究团队还将CODS引入CAR-T细胞设计中，开发了一种咖啡因控制的CAR安全开关（图4.E-F）。研究人员将CAR结构拆分为两个部分，并利用CODS介导其组装。在无咖啡因状态下，CAR能够正常识别肿瘤抗原并激活T细胞；加入咖啡因后，CAR复合物解离，信号传导被迅速关闭。实验结果显示，该系统能够使IL-2分泌下降约27倍，IC50为34.3 nM。由于人体饮用普通咖啡后血浆咖啡因浓度通常可达到数微摩尔水平，因此该系统有望通过简单的咖啡因摄入实现对CAR-T活性的有效调控。

图4：(A) 天然GSDMD蛋白的活化与膜穿孔机制。(B) 咖啡因诱导细胞焦亡机制：咖啡因使CODS1解离，释放GSDMD N端致死结构域形成膜孔。(C) CODS1-GSDMD表达构建体。(D) 咖啡因处理后细胞的LDH释放定量。(E) 咖啡因控制的CAR-T安全开关机制：咖啡因诱导分裂型CAR解体，迅速阻断T细胞杀伤活性。(F) 分裂型CAR构建体设计方案。

该研究开发了一个基于咖啡因的小分子诱导蛋白解离系统CODS，并利用AI驱动的从头蛋白设计策略，实现了对蛋白相互作用的快速、可逆调控。该系统具有较高灵敏度和良好的生物相容性，并成功应用于基因表达调控、焦亡诱导和CAR-T安全开关等多个场景，未来需在活体模型中进一步评估其体内稳定性和临床转化效能。将该AI设计策略拓展至其他小分子与靶标蛋白体系，有望开发出更多类型的靶向解离工具。总体而言，该工作为构建可编程的蛋白调控系统提供了全新的设计思路。

参考文献