Gut Microbes 11.0 | 16S+宏基因组+代谢组：广州医科大破解肠道菌群调控肾结石新机制

肾结石与肾纤维化、慢性肾病和肾癌风险增加有关，这极大地导致了医疗保健成本的上升。鉴于钙氧石的普遍性，目前的研究重点是钙石。肾CaOx结晶是一种以高草酸尿症、肾细胞损伤增加和晶体细胞粘附为特征的疾病，是CaOx结石形成的关键。

另一方面，肠道微生物组在肾结石病中的作用也日益受到重视。特别是Oxalobacter formigenes等草酸降解菌已被证明能够通过促进肠草酸分泌来降低尿草酸排泄。然而，肠道微生物群是否以及如何通过调节宿主代谢物（如胆红素）来影响肾晶体形成，仍然是该领域未解决的重要科学问题。本研究旨在探索肠道菌群调控的非结合胆红素代谢在肾草酸钙晶体沉积中的作用机制，为肾结石病的预防和治疗提供新的思路和靶点。

• 大鼠模型：24只大鼠随机分为对照组（饲喂标准粮）、结晶沉积组（饲喂含5%羟脯氨酸、HYP的粮）和结晶沉积+FMT组（HYP喂养+健康粪便菌群移植，健康FMT）。

• 果蝇模型：UCB摄入同样增加Malpighian小管（相当于肾）CaOx晶体滞留。

• 临床样本： 427对倾向评分匹配病例-对照研究。

16S rRNA测序、宏基因组测序、非靶代谢LC-MS、靶向代谢组；

实时定量PCR（qPCR）、Western Blot分析和免疫组化/免疫荧光。

采用宏基因组测序分析肠道微生物组成和功能基因的交替，以评估健康FMT首先重构肠道菌群的能力。观察到晶体沉积组肠道微生物群的α多样性低于对照组，健康FMT显著恢复。β多样性分析结果表明三组之间肠道微生物组成在物种水平上存在明显的聚类，还显示了三组肠道菌群的基因功能组成存在显著差异。然后，评估了使用健康FMT进行肠道微生物重建对减少HYP诱导的大鼠实验性肾结晶沉积的潜在影响。如图1A所示，healthy-FMT有效减轻HYP诱导的肾CaOx晶体沉积。这些结果揭示了晶体沉积大鼠肠道菌群的显著破坏，以及健康FMT在重建肠道菌群和抑制肾脏晶体沉积方面的强大作用。

为了确定将信号从肠道传递到肾脏并可能介导CaOx晶体形成的关键代谢物，还使用UHPLC-MS/MS分析了粪便代谢组学分析。鉴定出对照组、晶体沉积和晶体沉积+FMT组之间的1735种差异代谢物，包括羧酸及其衍生物、脂肪酸、苯和取代衍生物、类固醇和类固醇衍生物、有机氧化合物、吲哚及其衍生物、异戊二醇脂质、苯酚、吡啶及其衍生物以及其他化合物（图1B)。通路富集分析结果显示，卟啉代谢通路受到显著影响（图1C）。关键差异代谢物分析显示，与对照组相比，晶体沉积组粪便UCB显著增加；然而，与晶体沉积组相比，晶体沉积-FMT组的UCB显著减少（图1E）。粪便粪胆素是粪便UCB的最终代谢产物之一，是UCB还原的下游产物。多重比较的结果不仅验证了粪便UCB水平的变化，而且还表明，晶体沉积组的粪便粪胆素减少，并在健康FMT后恢复（图1F）。另外，粪便UCB水平与肾结晶沉积之间呈正相关，粪便粪胆素水平与肾结晶形成之间呈负相关（图1G）。

这些发现表明，UCB积累和向粪胆素的转化受损与肾结晶沉积大鼠中观察到的肠道微生物群失调有关，并且通过健康的FMT重建健康的肠道微生物群可以逆转这种代谢破坏。

图1. UCB是一种肠道代谢物，与大鼠健康FMT调节的肾脏CaOx晶体沉积相关

为了进一步研究循环UCB的改变，在另一个肾CaOx晶体沉积大鼠模型中检查了与UCB相关的血清和尿液生化指标。如图2A所示，EG给药诱导肾脏CaOx晶体沉积明显。晶体沉积组的血清和尿液UCB水平均升高（图2B，C）。相比之下，肝功能没有显著差异，AST和ALT水平表示（图2D）。还分析了与UCB相关的尿液代谢物。Crystal沉积组的尿UCB水平显著升高，而从肠道UCB代谢和肠道吸收后尿液排出的尿胆素原和尿胆素水平显著低于对照组（图2C）。

为了尽量减少性别和年龄的潜在混杂，分析了427名CaOx结石患者和 427 名对照的匹配队列。血清总胆红素、UCB、DBIL、Alb和DBIL/Alb比值的变化趋势与匹配前的结果一致（图3A-D，F）。值得注意的是，CaOx-结石组的UCB/Alb比率仍然显著升高（图3E）。

图2. 肾CaOx结晶沉积大鼠的循环胆红素活性强于对照组

图3. 性别、年龄匹配后对照组与CaOx结石患者组循环胆红素活性相对实验室指标比较

果蝇是研究肾脏CaOx晶体沉积的有效模型，因为它具有生物保守性且易于维护。功能类似于哺乳动物肾脏的 Malpighian小管的偏振光学显微镜显示，UCB的摄入显着增加了雌性果蝇草酸盐诱导的CaOx晶体保留（图4A）。同样，UCB的摄入也提高了雄性果蝇中草酸盐诱导的CaOx晶体保留（图4B），进一步支持UCB对晶体积累的性别独立性影响。此外，与对照组相比，在给予2 mM UCB27天后，在正常摄食的雌性苍蝇中观察到更多的自发CaOx晶体沉积（图4C）。

为了在哺乳动物系统中验证这些观察结果，研究者将研究扩展到肾脏CaOx晶体沉积的大鼠模型。UCB给药导致血清UCB水平显着升高，但对血清DBIL水平没有显着影响（图4D）；更重要的是，UCB处理增强了肾脏CaOx晶体沉积（图4E，F），与在果蝇中观察到的发现相似。此外，血清UCB水平与肾CaOx晶体潴留之间存在很强的正相关关系（图4G）强调了UCB作为肾CaOx晶体沉积中关键调节剂的潜在作用。

图4. UCB在体内加剧肾晶体潴留

在体外探索了UCB加剧CaOx晶体形成的机制。晶体细胞粘附测定表明，在低FBS条件下，UCB显着增加了草酸钙一水合物（COM）晶体对MDCK肾小管上皮细胞的粘附（图5A）。UCB还激活细胞凋亡相关蛋白，包括caspase-3及其底物聚[ADP-核糖]聚合酶1（PARP-1）（图5D）和泛半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK，显着减少UCB诱导的细胞死亡，抑制caspase-3和PARP-1的裂解（图5E，F）。

图5. UCB促进CaOx晶体与肾小管上皮MDCK细胞的粘附

鉴于高草酸尿症是肾小球滤过和肾小管分泌中CaOx结晶形成的关键危险因素，研究了UCB对肾小管草酸盐分泌的影响。与溶剂处理的对照相比，UCB处理增加了顶端的草酸盐浓度（图6B）。这种增加与基底外侧草酸盐浓度呈负相关，表明UCB的草酸盐分泌增强。

图6. UCB增加肾小管上皮细胞Slc26a6的表达，促进跨膜草酸盐排泄

CaOx晶体的形成和聚集是肾脏CaOx晶体沉积的关键早期决定因素。因此，作者研究了UCB是否影响这些过程。在CaOx和尿酸结石中均检测到UCB，表明其可能参与晶体形成（图7A）。UCB处理降低了晶体表面zeta电位的绝对值，表明晶体稳定性增强（图7B）。UCB还促进了CaOx晶体的成核（图7C），增加了COM晶体的形成（图7D），并增强了体外晶体聚集（图7E）。总的来说，这些发现表明UCB通过促进CaOx晶体的结晶和聚集来促进肾晶体沉积。

图7. UCB促进CaOx晶体结晶和聚集

肠道微生物群进行的肠道胆红素代谢对宿主健康至关重要。使用CAZy数据库对微生物宏基因组数据进行了进一步的注释，并根据EC：3.2.1.31（β-GD活性的特定EC编号）获取β-GD相关的unigenes。结果表明：与对照组相比，晶体沉积大鼠中β-GD相关unigenes的相对丰度显著增加，健康FMT也逆转了这种情况（图8A）。此外，观察到β-GD相关单基因的相对丰度与粪便UCB水平和肾晶体沉积之间呈正相关（图8B，C）。通过使用NR数据库注释eggNOG衍生和CAZy衍生的β-GD相关单基因，获得进一步的微生物物种信息。

相比之下，在晶体沉积大鼠中，与BilR同源的单基因的相对丰度显著降低，并且这种减少被健康的FMT逆转（图8D）。在BilR unigenes的相对丰度与粪便UCB水平和肾晶体沉积之间观察到显着的反相关（图8E，F）。BilR unigenes的减少主要归因于Marvinbryantia formatexigens、Eubacterium plexicaudatum和厚壁菌门细菌物种的变化（图8G，H）。这些发现表明，参与肠道胆红素代谢的肠道微生物群在肾脏CaOx晶体的大鼠中失调。这种生态失调可能与血清UCB水平改变和肾CaOx晶体沉积的形成有关。

图8. 肾CaOx结晶沉积大鼠肠道微生物β-GD相关基因、BilR相关基因和相关物种的改变

本研究整合16S rRNA测序、宏基因组学、代谢组学技术，首次揭示：肠道菌群失调→UCB代谢紊乱→肾草酸钙晶体沉积的新机制，为预防肾结石提供了菌群干预靶点（β-GD/BilR）和代谢标志物（UCB/Alb）。