M2点样仪制备生物传感器芯片用于发现鼻咽癌免疫标志物

免疫检查点（Immune Checkpoint）是一类免疫抑制分子。免疫检查点阻断疗法，则通过抑制程序性死亡受体及其配体结合,提高宿主免疫系统对肿瘤细胞的攻击性。尤其是免疫检查点阻断(ICB)抑制剂的发现，极大改善了癌症患者的预后。基于液体活检的生物标志物体外诊断方法，可使ICB治疗尽可能延缓肿瘤进展、延长患者生存期并提高患者生活质量。与目前临床化学发光和吸光度法的酶联免疫吸附检测（ELISA）相比，荧光免疫法（FIA）不依赖于酶活性或底物浓度，具有更好灵敏度，然而荧光团的低量子产率，有限的光稳定性和强自身荧光背景等因素制约，难以被临床广泛应用。

近年纳米技术的发展，促使具有表面等离子体共振的金属纳米结构，可通过金属荧光增强效应（MEF）有效放大荧光信号，以达到高敏诊断，同时长波近红外荧光(NIRF)具有较低的自身荧光干扰，明显提高检测结果的灵敏度和信噪比。因此，高灵敏度、高通量、能同时检测多种生物标志物的体外诊断方法，对于推动肿瘤患者的诊断、治疗和预后尤为重要。

来自华南肿瘤国家重点实验室，广东省鼻咽癌诊疗重点实验室以及中山大学肿瘤防治中心的杨江教授报道了一种基于生物传感器，用于高敏检测可溶性免疫检查点预测分子sICAM-1（细胞间黏附分子-1）和sPD-L1（细胞程序性死亡-配体1）的文章，题目为“A near-infrared fluorescence-enhancing plasmonic biosensing microarray identifies soluble PD-L1 and ICAM-1 as predictive checkpoint biomarkers for cancer immunotherapy”于2023年8月发表在国际生物传感器权威杂志Biosensors and Bioelectronics上。

该研究团队合成了一种基于金纳米岛状结构（AuNIS）的增强近红外荧光微阵列免疫分析 (eFMIA)生物传感器，具有丰富的纳米间隙，可将结构对称的IRDye78荧光分子的近红外荧光放大200倍以上。此外，利用M2非接触式压电驱动的生物打印技术（该打印技术具有分辨率高、打印速度快、高生物活性、材料浪费低等优势），多项性能优于传统的FIA和ELISA。eFMIA能检测肿瘤患者队列中sICAM-1和sPD-L1的标志物差异水平，发现相较于部分缓解（PR）的病人队列，疾病进展（PD）队列中存在sPD-L1高表达，sICAM-1低表达（见图1）。

图1:NIF增强等离子体微阵列检测示意图

作者使用德国M2-Automation公司的iTWO-200非接触式生物芯片点样仪，制备微孔板微阵列。点样环境的湿度为60%，温度为25℃，压电式皮升级喷头的点样体积为180 pL /滴，每个点重复5次。样品点印在纳米金结构包被的孔板上，随后使用生物素标记（IRDye78）的抗体孵育，荧光强度通过AzureSpot软件的NIFR检测及液滴点印稳定性分析（见图2）。

图2：非接触式PDMD喷头在AuNIS上制备具有NIRF增强的可控和可重复的微阵列。(A)PDMD点印过程示意图以及利用NIRF进行免疫检测的工作原理。(B)不同条件下合成的Au结构之间间隙距离的量化。SEM（扫描电子显微镜）、Binary（二进制图像）。(C)各种条件下合成的AuNIS归一化间隙分布，使用gamma分布函数对直方图进行拟合。(D)累积分布概况。(E)非接触式PDMD点印稳定性评估 (n=10)，单位pl。(F)喷点体积分布统计。(G) 头部质控相机对点印的2 × 3阵列质控图。(H)组内及组间点间距统计。(1)组内及组间荧光强度统计(n=10)。(J)字母“SYSUCC”图案的定制化点印阵列。

为了进一步利用eFMIA检测肿瘤相关的生物标志物，作者培养了两种人鼻咽癌细胞系S26和C666-1，首先通过RT-qPCR对ICAM-1和编码PD-L1的CD274 mRNA表达进行测定，发现在C666-1细胞中mRNA和蛋白表达均高于S26细胞。此外，ICAM-1和PD-L1在人血浆、血清以及PBS中无显著差异。众所周知，PD-L1存在于肿瘤细胞中以膜结合的形式抑制T细胞的免疫活性。为了检测鼻咽癌细胞是否会释放PD-L1，作者在C666-1细胞培养上清液中检测到分泌的PD-L1，且分泌水平随时间和C666-1细胞数量的增加而增加。从临床角度而言，识别低丰度或微量变化的生物标志物具有重大的临床意义。因此，作者招募了28名接受抗PD -1 ICB治疗的癌症患者，在第一次给药前1天采集血清进行eFMIA测定。结果显示，治疗前血清sPD-L1水平PD患者显著高于PR患者(0.42 vs 0.18 ng /mL)，相反，PR患者血清sICAM-1水平高于对照组PD患者 (0.92 vs. 0.60 ng /mL)（见图3）。

图3：检测鼻咽癌细胞和病人血清中的可溶性ICAM-1和PD-L1。(A) 检测两种鼻咽癌细胞系S26和C666-1中ICAM1和CD274 mRNA的表达。(B)鼻咽癌细胞中ICAM-1和PD-L1在S26和C666-1细胞系中的表达水平。(C) 1.6 nM ICAM-1和2.0 nM PD-L1的NIRF信号强度，PD-L1在PBS、20%人血浆和20%人血清中水平均增加。(D)不同C666-1细胞对应PD-L1的分泌水平，样本来自接受抗pd -1 ICB治疗的前癌症患者(n=28)的血清(E) PD-L1和(F) ICAM-1水平检测，根据内参标准归一化法进行NIRF相对平均强度计算。

研究者基于金属荧光增强MEF效应，制备了检测肿瘤患者外周血液样本中生物标志物的生物传感器。该传感器具有高灵敏度、高稳定性、高通量优势，可同时检测多种biomarker，且标志物之间相互干扰小，有望帮助临床医生决策、应用患者分层和预测ICB治疗疗效。

M2-Automation成立于2003年，总部位于德国柏林，是一家创新技术开发公司，专注于皮升/纳升级-超微量/微量、非接触式自动化移液和生物芯片点样技术。

环亚生物科技（APG BIO）作为德国M2-Automation公司中国区独家代理，为客户提供生物芯片点样、扫描以及高通量筛选的整体解决方案和服务。