代谢组学数据归一化新选择！GCxGC-TOFMS 赋能 TDPA 方法，大队列样本无需对齐也能精准区分样品差异

以干燥狗粮为基质，构建两组样品（纯狗粮组 DF、添加氨基酸标准品组 DFAA），通过系统递增样品质量模拟浓度变异（从160毫克到300毫克，以20毫克为增量，共8个质量梯度），明确两组间核心差异为氨基酸浓度。

样品经TMS衍生化后，采用全二维气相色谱-飞行时间质谱（GCxGC-TOFMS）进行检测，获取代谢组数据。通过 ChromaTOF® 完成峰识别、对齐及谱库检索，计算五种归一化策略对应的参数，利用 MATLAB® 及 PLS Toolbox 进行主成分分析（PCA）

本研究采用ChromaTOF®软件的Statistical Compare统计比较功能对36组经衍生化处理过的全二维数据进行比对。（该功能现已升级为SYNC组学软件，如下图所示）

使用ChromaTOF®软件自带的“Script脚本”功能开发的脚本，用于TMS衍生化峰的自动化过滤以计算 TDPA，如下图所示

上图为GC×GC-TOFMS 色谱图：（A）氨基酸标准品（B）160 mg 狗粮样品（C）添加了氨基酸的 160 mg 狗粮样品（D）300 mg 狗粮样品（E）添加了氨基酸的 300 mg 狗粮样品

36 个样品经数据对齐后共获得 1944 个峰，其中1021个峰为所有样品共有（用于计算 TUPA），59 个峰被鉴定为氨基酸的 TMS 衍生物（用于计算 TAA）

分析结果显示，样本的总离子流图（TIC）与TMS特征碎片离子（m/z 73）的提取离子流图（EIC）在视觉上几乎完全一致。这有力地证明了TMS衍生化方法是高效且普适的，分析中检测到的大部分代谢物都被成功转化为TMS衍生物。

上图为散点图集合，横坐标均为目标样品质量（160–300 mg），纵坐标分别对应不同检测指标，核心用于呈现各指标随样品质量的变化趋势及两组样品（DF 与 DFAA）的差异特征。

上图为每个样品的总峰面积（TPA）、总有效峰面积（TUPA）、总衍生化峰面积（TDPA）值，按所有样品对应指标的平均值进行归一化处理结果。

数值越接近 1（标准值），其作为归一化因子的效果越好。上图显示，TPA表现最差: TPA值随样本质量增加的线性趋势最不明显，且波动较大。这归因于TPA计算中包含了大量无关峰，如衍生化伪影和污染物。

TUPA和TDPA表现更优： 这两个因子的值随样本质量增加呈现出更稳定、更清晰的线性增长趋势，表明它们受无关信号的干扰较小。

在排除了样本质量和氨基酸浓度这两个预设变量的影响后，定量分析显示TPA的相对变异最大（9.69），而TUPA（4.91）和TDPA（5.27）的变异最小，证明后两者是更稳定的标准化因子。

上图为五种归一化策略下的PCA得分图（红色为DF组，绿色为DFAA组）

失败的策略 (A, B, C)：

• 未归一化 (A) 和 按样本质量归一化 (B) 的数据显示，两组样本的95%置信椭圆严重重叠，无法实现有效区分。

• TPA归一化 (C) 同样未能分离两组，并且数据点沿对角线呈现出双峰分布，揭示了该方法易受分析批次效应的影响。

成功的策略 (D, E)：

• TUPA标准化 (D) 表现最佳，两组样本的95%置信椭圆几乎完全分离，实现了清晰的组间区分。

• TDPA标准化 (E) 的表现几乎与TUPA相当，仅有一个样本点落入重叠区域，同样提供了非常显著的区分效果。

这一结果表明，TUPA和TDPA能够有效校正与样本相关的生物学变异，从而揭示出由氨基酸差异引起的细微变化。

在模拟样本获得的有前景的结果作为原理验证后，将 TDPA 应用于 54 个人类尿液样品（复杂生物样品），与肌酐归一化（尿液分析金标准）、TUPA 等方法对比。

TDPA 归一化后，尿液样品的组间分离度显著优于肌酐归一化，虽略逊于 TUPA，但无需依赖全样本数据对齐，可单个样品即时计算，更适配大规模、纵向研究场景，证实其实际应用价值。

TDPA 以 “无需数据对齐、操作便捷、适配大规模研究” 为核心优势，弥补了 TUPA 依赖全样本分析完成后才能计算的短板，为不同研究场景提供了灵活选择。

TDPA方法的提出和验证，为GC-MS代谢组学界提供了一个强大而简便的工具，有助于提高数据质量和研究结果的可靠性，特别是在那些因缺乏便捷方法而忽视标准化的研究中，其应用前景广阔。

GCxGC-TOFMS 凭借高分离度和灵敏度成为本研究的核心分析平台，其在 TMS 衍生化样品代谢组学分析中，除了提升峰容量外，对 TDPA 等归一化方法的性能发挥是否存在直接影响？

GCxGC-TOFMS 的技术特性与 TDPA 等归一化方法的性能密切相关，且这种影响是直接且关键的。

一方面，GCxGC 的二维分离能力可有效减少峰重叠，尤其能区分 TMS 衍生化产物与基质杂质等无关峰，降低 TDPA 计算中 “假阳性峰” 的干扰。 若采用传统一维 GC-MS，峰重叠率较高，可能导致 TDPA 筛选的特征峰中混入非衍生化杂质峰，影响归一化稳定性。

另一方面，TOFMS 的高灵敏度和快速数据采集能力(200张谱图/秒），能精准捕捉 TMS 特征碎片（如 m/z 73）的微弱信号，确保低丰度衍生化代谢物被纳入 TDPA 计算，避免因信号丢失导致归一化因子偏差。

此外，GCxGC-TOFMS 的高重现性（如保留时间稳定性、峰面积重现性）为 TUPA 所需的全样本峰对齐提供了基础，若仪器重现性不足，峰对齐误差会直接削弱 TUPA 的有效性。

因此，GCxGC-TOFMS 的技术优势不仅是数据采集的保障，更是 TUPA、TDPA 等归一化方法发挥优异性能的前提，二者形成 “高分离度分析 + 精准归一化” 的协同效应。

TUPA 与 TDPA 均表现出优异的样品分离效果，在实际研究中应如何根据实验设计选择这两种方法？二者与 QC-based 校正等技术结合后，是否能进一步提升数据可靠性？

TUPA 与 TDPA 的选择需结合研究规模、数据处理流程及时效性需求：若为小规模研究（样品数量＜100）、数据对齐难度低，且追求最高的组间分离精度，建议选择 TUPA；若为大规模、纵向研究（样品分析周期长、批次多），或需实时获取归一化结果以调整实验流程，TDPA 更具优势，无需等待全样本分析完成即可计算，且避免了大规模数据对齐的复杂操作。

二者与 QC-based 校正结合后，可进一步提升数据可靠性：TUPA 和 TDPA 主要校正样品制备相关的生物变异与部分技术变异，但无法完全消除仪器长期运行带来的批次效应（如色谱柱衰减、离子源污染），而 QC 样品可通过监控保留时间漂移、峰强度稳定性，对数据进行二次校正，尤其在大规模研究中，这种 “归一化 + QC 校正” 的组合策略能同时解决样品内变异与仪器系统性偏差，使差异代谢物筛选结果更稳健。此外，对于基质复杂的生物样品（如粪便、组织匀浆），建议优先选择 TDPA，其靶向 TMS 衍生化峰的特性对基质杂质的耐受性更强，抗干扰能力更优。