“金标准”的误判：X射线单晶衍射在四种天然产物结构鉴定中的局限性再审视

天然产物因其复杂的化学结构和多样的生物活性，一直是有机化学研究的重要方向。随着色谱分离技术、高分辨率波谱和质谱方法的不断发展，科研人员如今能够从极微量（亚毫克级）的纯品中成功鉴定新化合物¹。然而，尽管技术手段持续进步，天然产物结构鉴定仍然充满挑战，已有研究中结构误报的比例依然较高²-³。据近期研究估计，大约10%已发表的天然产物结构可能存在错误⁴⁻⁶，这类误判不仅影响基础研究的准确性，还可能造成大量资源被误用于追踪不存在的合成目标⁷。

与广泛采用的核磁共振（NMR）和高分辨率质谱 等分析手段相比，单晶X射线衍射（XRD）及其相关晶体学方法在结构鉴定中表现出更高的可靠性，误判案例较为罕见，因而被学界誉为小分子结构验证的"金标准"，其结论往往可与全合成验证相提并论²̕⁸̕⁹。尽管如此，晶体学方法也并非绝对可靠，仍可能发生晶胞参数设定错误、空间群指派不准或原子类型误判等问题¹⁰⁻¹²。虽然已有CheckCIF/PLATON¹³等验证工具能够有效识别部分晶体学偏差，但一些隐含错误——包括原子误定——仍有可能逃过检测¹²̕¹⁴。

在本研究中，我们结合对已发表光谱数据的重新解析，通过比对真实标准品、参照文献值，并辅以基于密度泛函理论（DFT）的NMR化学位移计算，对四种天然产物及两种半合成衍生物的结构提出了修正。值得强调的是，其中两种化合物的初始结构确定均依赖于单晶X射线衍射（XRD）数据的分析。

研究结果明确显示，即便被视作"金标准"的晶体学方法也并非绝对可靠，其在某些情况下存在明显局限——尤其是对原子序数相近的原子可能发生误判。本研究进一步凸显了DFT计算在预测NMR化学位移方面作为补充手段的重要价值：该技术能够有效解决结构解析中的不确定性问题，尤其在无法对晶体学数据进行重新精修时，发挥着不可替代的作用。

2001年，一项国际合作研究从泰国湾采集的日本蒂蒂海绵（Tetilla japonica）中分离得到两种天然产物，分别鉴定为tetillapyrone（1a）、其半合成二乙酸酯衍生物（2a）以及结构相关的天然产物nortetillapyrone（3a）（图1）²³。研究人员在报告中指出，这些化合物的波谱数据存在多处异常，给结构解析带来巨大挑战。最终通过丙酮缓慢蒸发培养的单晶X射线衍射（XRD）分析，提出了1a的吡喃酮-脱氧核糖苷结构，并通过谱学对比推定了2a和3a的类似结构。

图1. Tetillapyrone (1a)、Tetillapyrone二乙酸酯(2a)和Nortetillapyrone (3a)分别修正为胸苷(1b)、胸苷二乙酸酯(2b)和脱氧尿苷(3b)的结构示意图。（灰色框）本研究中考虑的额外互变异构体形式。原始归属中被错误识别的原子以蓝绿色标注。

本研究团队在开展核苷类抗生素持续研究²⁴过程中注意到该化合物类别，在分析其报道波谱数据与proposed结构间的关键矛盾后，开始关注这一案例。

原研究团队部分作者在2007年对从海洋海绵Haliclona baeri中分离的1a和3a的后续研究²⁵中修订了归属，指出C-5与C-3应为化学不等价，但仍未检测到新的共振信号——意味着C-5信号始终缺失。

基于上述关键矛盾，我们认为1a很可能实为等量异位（相同标称质量）且等排（相同原子数和分子形状，氢原子除外）的代谢物——胸苷（1b）。

通过对1a晶体学参数的比对分析，我们发现其与剑桥晶体学数据中心（CCDC）中收录的1b晶体结构高度吻合（表1），表明二者可能为同一化合物。尽管1a的晶体学R值较低（7.95%），但R值本身对结构正确性的判断有限，更适用于比较不同结构模型的合理性¹⁰。遗憾的是，CCDC中提供的1a晶体学信息文件不完整，无法基于1b结构对原始数据集进行重新精修并比较R值。

表2. 化合物1a和3a的报道核磁共振氢谱/碳谱数据与标准品1b和3b的对比（氘代二甲亚砜为溶剂）

^a 源自原始分离报告的NMR数据（300 MHz, 75 MHz）²³。报道的¹³C化学位移值已四舍五入保留一位小数。

^b 本研究采集的NMR数据（600 MHz, 150 MHz）。

^c 采用原始分离报告中的原子编号方案。n.r. = 未报道信号；obs = 被溶剂峰遮蔽。

近期，自埃及吉萨土壤来源的真菌 Aspergillus ochraceopetaliformis中分离得到的吡喃酮呋喃糖苷类衍生物 ochraceopyronide（4a）引起了我们的关注³²。在完成对 1a–3a 的结构修订后，我们注意到 4a 与上述分子在结构上具有明显的相似性。

值得注意的是，与 1a–3a 类似，4a 的 C-5 位同样未检测到¹³C NMR 信号，提示该化合物可能同样存在结构误判。

原研究作者曾推测 C-5 信号持续缺失可能是由于广泛的旋转异构现象导致信号分裂为多个难以检测的微弱信号，但即使在 80°C 下进行变温 NMR 实验，也未能观察到合并后的 C-5 信号。与 1a–3a 不同的是，4a 的研究提供了高分辨率质谱数据以支持其分子式。

我们初步推测所报道的分子离子峰可能来自某种可电离杂质，并进一步评估了 4a 实际为尿苷（4b，图2）的可能性。

图2. Ochraceopyronide (4a) 结构修订为spongouridine (4d) 示意图。（灰色框）本研究中考虑的关键对比结构：尿苷 (4b) 和 β-D-lyxouracil (4c)。原始结构归属中被错误识别的原子以蓝绿色标注。

本实验室对尿苷标准品（4b）的核磁共振（NMR）分析表明，其吡喃酮环区域的化学位移与文献报道的 4a 数据高度一致，但呋喃糖单元的信号存在显著差异（表S4），提示 4a 的真实结构可能为尿苷的一种非对映异构体。值得关注的是，原提案结构 4a 被描述为具有罕见的来苏糖呋喃构型，并曾被认为是首个天然来源的C-来苏呋喃糖苷。

为进一步探究，我们比较了 4a 及其互变异构体 4a′ 与具有相同来苏糖构型的 β-D-来苏尿嘧啶（4c）的预测NMR化学位移（表S5），同时以经合成验证的天然海绵产物海绵尿苷（4d）作为参照。计算结果显示，4d 与 4a 的实验数据匹配最优，其DP4+概率大于99.9%，δ_C 和 δ_H 的平均绝对误差（MAE）显著更低，强烈支持 4d 为 4a 的真实结构（图2）。在纳入所有可能的尿苷非对映异构体进行计算后，4d 仍保持高于99.9% 的DP4+概率（表S21），进一步证实了这一结论。

通过对比 4a 的报道数据与合成 4d 的实验NMR数据³³，发现两者高度吻合（表S6）。此外，4a（[α]_D²⁰ +100°，二甲亚砜）与 4d（[α]_D +97°，氢氧化钠水溶液）³⁴ 均表现出较强的右旋光学活性，提示二者可能具有相同的绝对构型，该推论尚需通过相同溶剂中的标准品比对予以确认。本研究通过DFT计算预测 4d 在二甲亚砜中的比旋光度为 [α]_D +122°（表S65），也为该构型提供了理论支持。

值得指出的是，4d 及其类似物海绵胸苷在海洋天然产物药物研发中具有重要历史地位。它们于上世纪50年代发现的抗病毒活性³⁴⁻³⁹，促进了核苷类抗病毒/抗肿瘤药物 Vidarabine 和 Cytarabine 的开发，后者成为首批受海洋天然产物启发并获得美国FDA批准的药物。本研究首次发现 4d 也可由真菌产生，据此提出一个值得深入探讨的假设：海洋海绵中该化合物的生物合成可能源于其内共生真菌。此前已有研究推测这类化合物可能具内共生起源⁴⁰，并有报道从 4d 和海绵胸苷的原始宿主——海绵 Tectitethya crypta中分离到可产生类似海绵苷的细菌内共生体 Vibrio harveyi⁴¹。

2023年，研究人员从红树林来源的内生真菌 Aspergillus sp. A1E3 中分离并报道了一种结构新颖的天然产物——rhizoaspergillin A（5a，图3）。该化合物被描述为首个 orsellinic acid–核糖–哒嗪酮-N-氧化物杂合体，其分子中包含一个独特的 β-氧代-2,3-二氢哒嗪-1-氧化物结构单元。这一特殊结构与它们的绝对构型均通过其半合成三新戊酰衍生物（6a）的单晶X射线衍射分析得以确定⁴²。

基于 5a 与此前已完成修订的化合物 1b–4b 在结构上的相似性，我们推测 5a 可能实为其等排异构体 kipukasin O（5b）——该化合物早一年由 Aspergillus polyporicola中报道⁴³。通过比对 5a 在氘代二甲亚砜和 5b 在氘代吡啶中的核磁共振（NMR）数据，发现二者高度一致（表S7），提示它们可能是同一化合物在不同溶剂中表征所得。

尽管无法通过CCDC编号2291154获取原始晶体学数据（该编号查询未返回有效结果），我们仍对原分离文献中所提供的 6a 的ORTEP图进行了仔细分析。分析显示，C-4原子的位移参数显著小于相邻碳原子，而N-1的位移参数则明显大于邻近N-2原子。该类异常与常见原子误判特征相符，表明C-4实际应为氮原子，而N-1实为碳原子，从而支持 6a 的真实结构应修订为嘧啶二酮类衍生物 6b。

为验证该假设，我们采用密度泛函理论（DFT）计算对化合物 5a、5b、6a 和 6b 的NMR化学位移进行了预测（表S8、S9）。计算结果表明，5a 和 6a 应分别修订为 5b 和 6b，两种修订的DP4+概率均大于99.9%，显示出极强的统计支持。尤其具有诊断意义的是杂芳香环系统中C-2与C-4原子的预测¹³C化学位移值：

上述计算数据从理论化学层面为结构修订提供了坚实依据。

本研究通过综合运用标准品对照、文献数据比对及基于DP4+统计框架的DFT-NMR化学位移计算，对四种天然产物和两种半合成衍生物的结构进行了系统性修订。值得注意的是，其中两种被误判的化合物（1a 和 6a）曾经过单晶X射线衍射分析——这一被广泛誉为小分子结构解析"金标准"的技术。然而，晶体学数据的不完整公开与标准验证流程的缺失，可能是导致这些错误结构长期未被发现的重要原因。

在多起案例中，结构误判凸显出研究者在去重复化过程中未能充分考量已知代谢产物的存在。这些发现不仅揭示了晶体学方法在实际应用中的局限性，更强调了多技术平台协同验证的必要性：

本研究为天然产物结构鉴定提供了方法论层面的重要参考，警示研究者即使对"金标准"技术也需保持批判性思维，并通过多维度证据链确保结构归属的准确性。