【First-in-class药设系列】生成式深度学习驱动的全新抗生素设计

目前，抗生素耐药性已成为一项紧迫的全球公共卫生危机，每年导致约五百万人死亡。随着现有抗生素的耐药性问题日益普遍，而新型有效疗法却严重匮乏，诸如淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）等病原体，已被美国疾病控制与预防中心列为“紧急”和“严重”级别的公共健康威胁。因此，我们亟需结构新颖、尤其具备独特作用机制的化合物，以应对耐药菌感染。然而，新型抗菌药物的研发进展显著缓慢。在1980年至2003年间，全球前15大制药公司仅开发出五种新型抗菌药物。由于抗生素发现过程耗时漫长且资源消耗巨大，采用计算方法以加速候选药物的识别显得尤为重要。

近年来，深度学习技术，尤其是图神经网络（Graph Neural Network, GNNs），已成功应用于大规模计算机筛选数百万化合物的抗菌活性。但这类方法大多局限于已有化合物库，理论上药物化学空间包含约10^60种可能化合物，而目前最大的计算机化合物库仅涵盖约10^11个分子，两者之间存在巨大差距，这一差距极大限制了对化学结构多样性的探索潜力。为突破这一限制，生成式人工智能（Artificial Intelligence, AI）提供了一种全新途径，能够超越已知化学空间的边界，实现从头设计创新分子。在筛选策略方面，本研究摒弃传统以靶标为中心（即针对特定蛋白质）的方法，转向表型指导的策略——直接筛选对那些对整个细菌细胞具有抑制活性的化合物。该策略不仅更有可能发现具有新颖作用机制的抗菌药物，还有望降低由于靶点选择偏差而导致的后期研发失败风险。

由于化学片段是构成药物生物活性的基础，研究人员希望先通过计算的手段筛选出关键化合物片段，再在此基础上使用生成式模型进行最终化合物的设计。他们采用了一套经过预训练的GNN模型——Chemprop，并对其预测能力进行了额外验证，以确保其能可靠地区分活性与非活性分子。在利用图神经网络模型预测抗菌活性的同时，他们还额外构建了另一组成毒性预测模型，对三种人类细胞系（HepG2、HSkMCs和IMR-90）进行关键的细胞毒性反向筛选，从而在从源头保障分子的安全性。另外为了保证分子片段的全面性，该研究团队还通过整合了GDB-11、GDB-13及Enamine REAL片段库，构建了一个包含超4500万个独特化学片段的庞大数据库。通过对该化合物片段数据库的化学空间可视化分析发现该数据库中化合物结构多样性远超现有已知抗生素，覆盖了极为广阔的未知化学空间。

在前期工作基础上，他们针对两个不同体系开展了抗生素设计的工作。首先，以淋病奈瑟菌为目标进行抗生素的设计，采用图神经网络对片段库进行虚拟筛选，预测其对淋病奈瑟菌的抗菌活性。初步筛选共得到 3,844,505 个预测具抗菌活性的片段，占总量的 8.4%。进一步，他们实施了多轮过滤筛选：首先排除在三种人类细胞系（HepG2、HSkMC 和 IMR-90）中任一株显示细胞毒性的片段；其次，去除所有含泛实验干扰子结构（pan-assay interference substructures, PAINS）的片段，以规避非特异性结合、毒性、反应性及代谢不稳定等问题；最后，要求剩余片段与559种已知抗菌化合物中任意一种的 Tanimoto 拓扑相似度均低于 0.5，以确保结构新颖性。经过逐层筛选，最终获得 1,156,945 个唯一片段。

为验证该筛选方法识别抗菌小分子片段的有效性，他们从 Broad Institute 的 799,149 个化合物中检索出包含任一上述片段的完整分子，并进一步筛选出预测具有抗菌活性、无细胞毒性、不含 PAINS 或 Brenk 亚结构，且与已知抗生素结构差异显著的化合物。最终获得 66 个分子，对应 27 个片段，用于抑制淋病奈瑟菌 ATCC 49226 的实验验证。实验结果表明，在 50 μM 浓度下，有 7 个分子能够有效抑制该菌株的生长。特别值得注意的是，片段 F1 同时存在于两个活性 Broad 化合物（BRD1 和 BRD2）中，其最低抑菌浓度（MIC）均在 8–16 μg/mL 之间，显示出良好的抑菌潜力。尽管BRD1和BRD2表现出良好的抑菌效果，但其治疗指数仍处于中等水平。此外，在现有商业化合物数据库中，几乎检索不到与F1结构相近的其他分子。因此他们认为目前难以依赖现有库筛选进一步提升药物潜力，必须借助生成式方法从头设计新结构。

为此，他们开发了两种基于机器学习的生成算法，用于构建全新分子：第一种方法是 F-CReM，这是一种基于遗传算法的化学合理突变策略。该方法以初始分子为起点，通过原子或官能团的添加、替换或删除，系统性地产生结构变异体。团队采用定向优化策略，在每轮生成后使用GNN模型对新生分子进行抗菌活性预测，仅保留高分分子作为下一轮突变的种子。经过五轮迭代，最终生成超过51万个含有F1骨架的新化合物。第二种方法则是F-VAE，基于变分自编码器架构。该模型通过编码器将分子结构压缩为潜在向量，再经解码器逐步扩展F1片段，逐个原子地构建出完整分子。利用这一方式，F-VAE 共生成近700万个含F1的全新分子。

生成完成后，团队对这两类大量分子进行了多轮计算筛选，综合评价其预测抗菌活性、细胞毒性、结构新颖性以及合成可行性。最终从CReM遗传算法生成的518,203个分子中筛选出285个候选分子，而从F-VAE方法产生的6,937,677个分子中筛选出678个，作为后续实验验证的重点对象。这些筛选获得的候选分子随后进入了实验制备与验证阶段。然而，深度学习生成的化合物的合成路线的确定一直是一个难点。为获得一批结构多样、数量合理且易于合成的候选分子，我们优先选取了结构差异显著且预测抗菌活性分数较高的化合物。最终筛选出80种化合物，交由商业合成供应商进行评估。在尝试合成的27种化合物中，有两种成功合成，且均出自F-VAE模型。

研究团队随后对NG1和NG2进行了抑制淋病奈瑟菌的实验验证。结果显示，NG1表现出极强的抗菌活性，其最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentrations, MIC）低至 0.5 μg/mL，而NG2在该测试中未显示活性。此外，NG1对人体细胞的毒性也极低。进一步的抑菌谱测试表明，NG1是一种窄谱抗生素，主要作用于致病性奈瑟菌属（如淋病奈瑟菌和脑膜炎奈瑟菌），但对人体共生的奈瑟菌属以及其他测试的革兰氏阳性与阴性菌均无抑制效果。最关键的是，NG1对高度耐药的淋病奈瑟菌菌株仍然有效，包括对所有一线药物均产生耐药的菌株。

在完成前期活性验证后，研究团队进一步探讨了NG1的杀菌特性及其分子机制。时间杀菌实验显示，NG1对淋球菌ATCC 49226具有浓度依赖的杀菌效果，与阿奇霉素相当，其最低杀菌浓度（minimum bactericidal concentration, MBC）为1μg/mL。耐药性诱导实验表明，NG1在8倍MIC浓度下诱导自发突变的频率极低，且获得的耐药突变株对头孢曲松、阿奇霉素等临床常用抗生素仍保持敏感，这也间接说明其作用机制不同于现有药物。

为进一步阐明其独特机制，团队通过棋盘试验评估NG1与头孢曲松、磷霉素及CCCP的联合效应。结果显示三者与NG1均无协同或拮抗作用，表明确实存在独立于细胞壁合成与质子动力势（proton motive force, PMF）调控的新型机制。后续膜流动性实验表明，NG1可显著降低细菌细胞膜流动性，并破坏膜完整性，使NPN和SYTOX green等膜不通透性探针进入胞内。为识别其直接靶点，团队采用蛋白质组积分溶解度改变（proteome integral solubility alteration, PISA）技术，发现NG1特异性地使得脂寡糖转运蛋白LptA变得极不稳定。RNA测序结果进一步验证了这一结果 ，他们发现lptA基因表达显著上调，认为这是细菌应对靶点扰动的代偿反应。通过上述一系列实验最终确认LptA为NG1的关键作用靶点。该靶点此前虽被理论提出，但一直缺乏实际靶向药物，本研究发现为其成药性提供了关键证据。

在安全性方面，NG1展现出良好的体外毒理学特性：其靶点LptA在真核细胞中不存；在体外实验中在浓度高达64 μg/mL时未显示溶血性及诱变性。进一步的动物实验使用小鼠淋球菌阴道感染模型，阴道内给予NG1可显著降低细菌载量约3个数量级，且所有受试动物均表现出良好耐受性。在初步明确先导化合物NG1的活性基础上，研究团队合成了74种结构类似物，重点修饰其吡咯烷环及胺基上的R1与R2官能团，以系统探索构效关系并提升药物性能。活性测试表明，其中8种化合物对淋病奈瑟菌具有抑制活性，MIC介于16–32μg/mL。此外，团队从Enamine商业库中获取了4种类似物，发现其中一个称为“NG1 analog”的化合物抗菌活性显著提高（MIC = 4μg/mL），且细胞毒性低于NG1，显示出更优的安全性与开发潜力，机制研究证实其作用方式与NG1一致。

最终通过上述一系列工作研究团队成功发现了一个结构新颖机制新颖的抗菌药物，在完成淋病奈瑟菌抗生素的设计后，研究人员又将目光转向了革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌。基于相同策略，研究团队对包含超过4500万个片段的数据库开展了新一轮虚拟筛选。经过与上一案例类似的多步过滤（包括预测抗菌活性、低细胞毒性、无化学警示结构及高结构新颖性），最终获得约26万个独特候选片段。为验证本轮筛选结果，团队选取了130个市售化合物（对应68个筛选片段）进行实验测试，其中19个化合物显示出抗菌活性，真实发现率约14.6%，再次印证了该计算筛选策略的有效性与可移植性。在活性化合物中，一个名为F2的片段表现尤为突出——其所在分子EN1对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S. aureus, MRSA）及敏感菌株（methicillin-susceptible S. aureus, MSSA）均表现出较强抑制活性（MIC = 8 μg/mL），并展现出良好的细胞选择性。

    F2片段具有一种独特且较为罕见的1,4-环氧环己烷结构。在一个包含640亿化合物的庞大数据库中，仅发现38个分子含有该片段，其稀缺性使其成为扩展相关化学空间的理想分子骨架。为此，研究团队再次采用F-CReM与F-VAE模型，以F2为起点生成数百万个新分子。然而，经化学家评估，筛选得到的高优先级候选分子合成难度过高，难以在常规时限与成本约束下实现。为克服合成障碍，团队采取了一项关键策略：将复杂的F2片段进行截断优化，保留其核心药效团，得到更易于合成的简化片段F2''。基于F2''重新运行生成模型后，团队成功设计并合成出16个新分子。

最终，团队对两类分子进行了抗菌活性测试：一类为基于原始F2片段的市售分子，另一类为基于简化片段F2''的新合成分子。测试结果显示，F2来源的分子表现出较高活性，12个中有6个具备抑菌效果，命中率达50%，最高活性分子的MIC值低至16μg/mL；而F2''来源的分子中，仅1个显示微弱活性，命中率仅为6.25%。该结果明确表明，F2片段完整而复杂的化学结构是其抗菌活性的关键。试图通过简化结构以提高合成可行性，反而导致活性显著下降，说明在该系列中结构完整性对维持药效至关重要。至此，基于片段的药物设计策略在F2系列化合物中陷入僵局。为突破这一瓶颈，研究团队转向了一种全新的策略——从头设计（de novo design），旨在完全不依赖现有化学片段，从头生成具有抗菌潜力的全新分子。

研究团队构建了两种不同的生成模型用于实现这一目标：其一是基于遗传算法的CReM模型，以氨、甲烷或水等极小分子为起始输入；其二是基于 Junction Tree 变分自编码器（junction tree variational autoencoder, JT-VAE）的生成模型，该模型不预设任何片段结构，完全自由地生成全新分子。两种模型共生成超过2900万个分子，JT-VAE 在生成质量上显著优于CReM：JT-VAE 所产生的分子不仅更具“类药性”，其结构也更为合理；而CReM 生成的分子普遍存在分子量过大、合成可行性低等问题。研究团队对JT-VAE生成的分子进行了多轮严格的计算筛选，最终从中选出90个候选化合物，经合成评估后，成功采购并实验测试了22个全新分子。实验结果发现在22个测试分子中，有6个（命名为DN1–DN6）表现出抗菌活性，命中率达27.3%。这些活性分子彼此结构差异显著，说明JT-VAE模型能够生成具有多样化骨架的有效化合物。其中，DN1的活性最强、选择性最高，对MRSA和MSSA的MIC均为4μg/mL，且治疗指数达到了32，显示出优良的杀菌效果与较高的安全性。

在对de novo设计获得的活性分子DN1–DN6完成初步表征后，研究团队选取其中活性最优的分子DN1，就其耐药性及体内药效展开了系统评估。研究团队发现其具备优异的耐药性特征：杀菌速度快于万古霉素，自发耐药频率极低，且对多种耐药革兰氏阳性菌均显示出强效抑制（MIC = 8 μg/mL）。进一步在小鼠MRSA皮肤感染模型中验证其体内效果，局部施用1% DN1可使细菌载量下降至对照的十分之一，疗效与阳性对照药物夫西地酸相当，展现出良好的治疗潜力。

研究团队通过系统修饰DN1的结构探索其构效关系，主要针对芳环卤素类型、位置以及中心杂环进行改造。在合成的19种类似物中，5种对MRSA、MSSA及耐药金黄色葡萄球菌均表现出较强活性（MIC = 2–8 μg/mL）。其中，化合物DN1-164活性显著提升，对测试耐药菌及淋病奈瑟菌的MIC均 ≤ 4 μg/mL，且治疗指数（TI）高于32，未出现毒性增加。机制研究证该化合物和DN1一样也是通过破坏细菌膜电位（ΔΨ）发挥作用。

    综上，本研究成功建立了一套基于生成式深度学习与表型筛选的全新抗生素开发流程，并分别针对淋病奈瑟菌和金黄色葡萄球菌展开了系统性研究。通过大规模虚拟筛选与多轮实验验证，团队发现了具有新颖结构和独特作用机制的化合物。该工作不仅为应对耐药菌感染提供了多个前景广阔的候选化合物，更为未来抗生素研发提供了一条融合人工智能、计算模拟与实验验证的高效创新路径。

参考文献

Aarti Krishnan, Melis N Anahtar et al. A generative deep learning approach to de novo antibiotic design. Cell. 2025, S0092-8674(25)00855-4. doi: 10.1016/j.cell.2025.07.033.