【First-in-class药设系列】对映选择性芳香亲核的工程酶设计与优化

芳香亲核取代反应(SNAr)是药物化学应用最广泛的反应之一，通过富电子基团取代芳香环上的离去基团，构建C-C和C-X (X = O, N, S)化学键，合成复杂结构的有机分子。但传统上SNAr反应通常需要较强的反应条件下进行，比如使用极性非质子溶剂、化学计量比的强碱和高温，这些条件导致难以控制反应的选择性。最近开发了少量的对映选择性催化方法，比如涉及小型有机氢键或相转移催化剂等，但这些有机催化剂的效率有限，且不能很容易地适用于新型底物。当前，没有已知的天然酶可介导选择性SNAr反应，受此问题启发，英国曼彻斯特大学的研究人员采用了一种“自下而上”的方法，设计出了可高效催化对映选择性的SNAr的生物酶。

从反应机理上，SNAr反应涉及亲电试剂芳基卤化物与碳、氧、氮或硫亲核试剂的偶联。如上图，2-氰基丙酸乙酯拥有一个酸性极强的亚甲基，这个亚甲基夹在两个强吸电子基团（氰基-CN和酯基-COOEt）之间；而2,4-二硝基氯苯由于两个硝基的强吸电子共轭效应，使其极易受到亲核试剂的进攻，氯原子非常容易离去。

为了确定一个合适的起始模板来设计SNAr酶，研究人员利用了具有活性位点特征的MBH酶家族。在底物位点，这类酶均含有一个灵活的Arg残基作为氢键供体，位于缺乏电子的芳香底物附近。考虑到增加氢键的催化过程已经被证明可加速SNAr反应，他们首先使用芳基卤化物和碳亲核试剂进行筛选，确定了BH32.8变体（后称为SNAr1.0），可促进2-氰基丙酸乙酯和2,4-二硝基氯苯的偶联，并具有一定的转化率和立体选择性。

为了进一步提高酶活性和选择性，他们对SNAr1.0进行了三轮的进化。首先对底物位点和次级配位球附近的41个残基使用NNK简并密码子进行随机突变，后通过超高效液相色谱监控化合物1和2转化为3的反应情况，并选择其中最好的突变体进行下一轮的突变，最终将得到的有希望突变体组合。在对大约4000个克隆进行评估后，他们最终发现了包含6个突变的SNAr1.3变体。

SNAr1.3能够实现93%的转化率与96% e.e.的立体选择性，且生成的唯一产物是产物3。通过动力学实验测试催化反应情况，他们发现反应动力学常数可提高160倍。SNAr1.0和SNAr1.3的表观速率常数分别为0.0040±0.0002 min-1和0.65±0.01min-1，随后在化合物1的饱和浓度下测试反应动力学，结果kcat/kM1增强160倍。此外，当磷酸盐缓冲盐水(PBS)缓冲液变成磷酸二钠(NaPi)，使SNAr1.3反应速率能够进一步提高3倍，主要由于较高的氯离子浓度阻碍酶催化性能(IC50=147±32 mm)。

为了探索不同的卤化物离去基团对SNAr1.3催化活性和选择性的影响，他们使用芳基溴和碘类似物进行测试，发现酶催化活性分别提高3.8倍和8.6倍。当使用芳基碘底物时，SNAr1.3反应速率可达8.81±0.11 mM-1 min-1，产物3的立体选择性超过99% e.e.，且酶催化反应的转化数可超过4000次。在通过制备量的反应时，仅使用0.5mol%的SNAr1.3，能够实现>99 %的转化率、91%的分离收率和99% e.e.立体选择性。

进而，通过不同亲电和亲核偶联反应物的兼容性测试，他们研究了SNAr1.3的转化范围，发现SNAr1.3对许多亲电试剂硝基芳烃兼容，包括氰基、三氟甲基、酯、酮、砜与吡啶环，具有较好的e.e.立体选择性，且无副产物生成。此外SNAr1.3对亲核试剂具有较好的兼容性，比如酯、酰胺、2-烷基取代基与β-酮酯，与化学催化的现象有着明显区别。

为了体现该酶的应用意义，他们选择了1,1-双芳基季碳结构化合物来进一步验证。1,1-双芳基季碳结构化合物是生物活性分子中常见的结构特征，它的构建是一个很大的挑战。他们使用SNAr1.2测试了2和2-氰基-2-苯基乙酸乙酯的反应，实现了适中的转化率和立体选择性。后通过额外的一轮定向进化得到突变体SNArPh1.0，活性是SNAr1.2的3倍，并且立体选择性达到84% e.e.。当使用芳基碘化物作为反应物替代芳基氯，转化率能够提高至96%，立体选择性达到87% e.e.，表明SNArPh1.0能够作为具有应用价值的催化剂合成各种1,1-双芳基化产物。

综合利用生化实验、结构表征和理论计算，他们揭示了SNAr1.3的催化反应机制以及进化是如何增强酶催化反应的活性，提出SNAr催化可能类似4-氯苯甲酰-CoA脱卤酶通过形成酶-底物共价中间体的假设。为了验证这个假设，他们在无亲核偶联试剂的情况下将SNAr1.3和芳基卤化物放在一起培养，随后检测卤化物的产生以及蛋白的质量变化情况，发现在SN Ar1.3与亲电试剂5的孵育下，发生了缓慢的芳基化，大约60%的蛋白质在10分钟后被修饰。后续实验表明，这是最后一轮工程引入的Cys96残基所导致，虽然Cys96对SNAr的催化是有益的，但不是关键的。

他们解析了晶体结构（1.8 Å）来明确SNAr1.3的反应机理，基于结构和蛋白表面K39A突变分析，发现SNAr1.3与SNAr1.0没有显著差异。随后，他们发现Arg和Asp是天然蛋白质中卤化物底物的结合位点，同时在芳基底物的下部有另一个空腔，能够用于容纳亲核性的偶联反应物。

对卤化物结合位点进行位点选择性突变研究。R124A和D125N/A突变能够将反应速率降低180倍或者68/22倍，M64A和R65A变体导致反应速率降低5.4倍或10倍。这些研究结果进一步说明，卤结合口袋对高效催化的重要性。

由上图可见，大部分突变保留了高水平的选择性，但R124A突变导致了对映体选择性的大量丧失。这表明Arg124也可能进行选择性催化。分子动力学模拟显示，1的烯酸酯与Arg124形成氢键相互作用的构象，48%的结构中存在烯化酸酯和Arg124之间的桥接水，28%的框架中观察到直接的Arg124-烯化酸酯氢键。

    综上，本研究为SNAr催化反应提供了一种生物催化的酶解决方案。通过构建可高效形成四级碳立体中心的酶，实现卓越的催化活性、选择性和底物兼容性。仅筛选了4000个变体，就获得了性能优异的SNAr催化剂，包括适用于活性较差的亲电试剂和亲核试剂的体系。同时，结构与机制研究为SNAr1.3活性位点的高效选择性催化机制的解释提供了依据，将推动更多有价值SNAr变体的开发，促进现有药物化学高效合成的发展。

参考文献

Lister T M, Roberts G W, Hossack E J, et al. Engineered enzymes for enantioselective nucleophilic aromatic substitutions. Nature, 2025,639(8054):375-381.DOI:10.1038/s41586-025-08611-0.