蛋白质对于执行生命所必需的功能至关重要。由遗传变异、可变剪接和翻译后修饰（PTM）产生的proteoforms决定了生物体的功能，并在分子水平上驱动细胞功能。

ProteoformX™是一个功能强大、用户友好的软件平台，旨在使Intact Mass、Top-down的质谱分析变得更具操作性。它结合了快速完整的质量分析，以全面评估可检测的Proteoform多样性，并进行深入的自上而下的分析，以解决蛋白质全序列，定位修饰，并实现定量分析。

图 1. 修订版中心法则与蛋白质形式的形成 [1]

核心功能

• Intact Mass（完整分子量）分析

• Top-down（自上而下）蛋白质组搜索

• Proteoform Manager

完整质量分析

高精度质量解卷积

基于特征峰的质量解卷积算法能够以高灵敏度和特异性识别proteoform的质量，适用于同位素区分的高分辨和低分辨的数据，可处理广泛的样本类型。

图2.同位素解析数据的高精度质量解卷积图 

带修饰和ADC药物有效载荷样本的全面注释

完整分子量分析工作流可为proteoform复合体和亚基提供准确注释，即使是带有修饰和 ADC 药物有效载荷的高度异质性的样本也适用。

图3.曲妥珠单抗-美坦新的完整质量分析图

蛋白质水平上的糖基化分析

完整分子量解卷积技术可精确检测抗体混合物中的糖基化proteoform。

图4.蛋白质混合物糖型的完整分子量质量图

抗体重链与轻链配对分析

完整分子量蛋白质注释可确定抗体重链与轻链的配对方式，从而对所有抗体形式（包括不对称抗体和混合物）进行全面表征。

图5.抗体重链与轻链配对分析图

全面的结果可视化

ProteoformX™ 提供全面的结果展示，包括带有注释峰的交互式谱图视图以便用于透明化解析），以及解卷积得到的所有质量数表格中support feature信息，可直接用于指导靶向top-down的MS/MS实验。

图6.Proteoform的完整质量分析图形用户界面(A.带注释的质量表；B.解卷积质谱图；C.包含Support feature的完整解卷积质量表；D.总离子流图；E. 原始谱图)

灵活定义和可视化Proteoform变体 

ProteoformX™ 的Proteoform Manager提供直观的用户交互界面，用于定义链内和链间连接、切割位点、位点特异性翻译后修饰（PTMs）及糖基化。这些功能支持对与生物制药分析相关的复杂Proteoform进行全面建模。

图7.Proteoform manager

Top-down Proteome search

Top-down质谱技术可实现Proteoform的表征，包括精确的翻译后修饰定位。然而，数据复杂性和序列覆盖度有限等挑战可能会限制分析和通量。在ProteoformX™中，其用户界面可帮助用户对从原始数据到鉴定结果的全流程进行手动核查。该软件平台支持多种碎裂方法（CID、HCD、ETD、ETHCD，UVPD）

追踪每个proteoform，数据信息分级洞察

直观的分层视图帮助用户探索从protein到proteoform，再到谱图的匹配细节。

在“protein view”中，Protein coverage显示与proteoform被映射其相关的蛋白质序列上。使用灰色条来表示该区域具有质量偏移或者有翻译后修饰但未找到碎片离子用于其定位。右键单击可跳转至Proteoform表以显示具体信息。

在proteoform coverage视图中，显示了详细的proteoform信息，覆盖显示了碎片离子匹配信息，以及序列上方的修饰或质量偏移。

图8.proteoform覆盖的protein view

深入了解Proteoform tab，可以看到每个proteoform鉴定结果是如何以高质量PrSMs（Proteoform Spectrum match）、碎片离子质量表和交互式序列碎裂图作为支撑的。 

ProteoformX™的“Spectrum tab”将理论母离子峰和碎片离子分别直接叠加到MS1和MS2谱图上，可直观看到同位素峰簇分布，评估离子隔离窗口，精准定位参与解卷积的离子，获取哪些谱是来自嵌合谱图的信息。不同颜色和形状注释清晰区分离子类型，匹配与未匹配碎片，为结果提供透明度与可信度。

图9.Proteoform视图-PrSM

图10.Proteoform视图-原始谱图

以特征峰洞察TD数据（LC-MS视图）

作为用于完整蛋白质和自上而下分析的基于特征峰的算法，ProteoformX™ 提供包含 ms/ms 谱图及其相关特征峰的LC-MS视图。可放大以详细查看每个特征峰。

图11.LC-MS视图

深入的Top-down蛋白质组鉴定与开放搜索（open search）

通过启用OpenPTM搜索功能，允许检测预期以外的修饰和蛋白质的截断形式，从而提升Proteoform的鉴定能力。在以下示例中，未启用OpenPTM搜索时仅鉴定出B8ZZQ6蛋白的2种C端Proteoform，而启用后可检测到8种。其中新增的一种Proteoform呈现–89.03 Da的质量偏移，这与N端蛋氨酸缺失伴随乙酰化修饰（一种常在Protein N端被观察到的修饰）的特征一致。通过扩展搜索空间以包含质量偏移和非规范末端[non-canonical termini]，OpenPTM搜索可实现更全面的Proteoform分析。

图12.带有可变修饰的蛋白质及其Proteoform覆盖度视图

图13.采用open search的蛋白质及其Proteoform覆盖度视图

参考文献

1.Roberts, D.S., Loo, J.A., Tsybin, Y.O. et al. Top-down proteomics. Nat Rev Methods Primers 4, 38 (2024). https://doi.org/10.1038/s43586******/p>

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