产品介绍

英文名：Phenyl Agarose 6FF（Low Sub）

纯度：BioReagent, 70% v/v; 90 μm

货号：P1524350

存储温度：2-8°C储存,禁止冷冻

产品介绍：

疏水层析法 (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) 是采用具有适度疏水性的配基作为固定相（如Butyl、Octyl 、Phenyl，疏水性从弱到强排序），以含盐的水溶液作为流动相，利用溶质分子与固定相间疏水相互作用的强弱不同而实现分离的层析方法。疏水层析介质特征是其表面含有疏水性配基，是不同长度的烷烃或芳香族化合物。

苯基琼脂糖凝胶6FF (低取代) 是以高度交联的琼脂糖微球为基质，平均粒径 90 μm，用稳定的化学键把功能基团固定到琼脂糖微球上，配基不含带电荷基团，使得真正的疏水层析成为可能，不会干扰离子效应，流速快、应用广，是生物大分子规模分离纯化常用的介质之一。

苯基琼脂糖凝胶6FF (低取代) 综合使用性能优异，支持高流速上样，能够有效提升纯化作业效率；微球粒径均匀统一，保障每一次层析实验的分离效果；理化稳定性优异，耐受反复清洗与再生，使用寿命更长；实验重复性佳，批次之间性能偏差小，数据稳定性高；生产工艺成熟，可轻松实现从实验室小试到工业化大规模生产的线性放大；基质亲水性优良，对生物样品非特异性吸附极低，有效减少样品损耗；产品适配场景广泛，通用性强，可满足多种生物大分子的疏水层析纯化需求, 特别适用于分离的初始捕获和中间纯化阶段。

阿拉丁的苯基琼脂糖凝胶6FF (低取代) 储存在20%乙醇，凝胶和保护液的体积比为7:3，我司产品规格为实际凝胶的体积。

参数	指标
基质	6%高度交联琼脂糖
平均粒径	90 μm
配基	苯基
配基密度	25 μmol/mL
建议流速	＜400 cm/h
建议压力	＜0.3 MPa（3 bar）
化学稳定性	在常用水溶性缓冲液中稳定，如 1 mM HCl、1 M NaOH(仅供清洗使用）、30% 异丙醇、6 M 盐酸胍、8 M 尿素等
储存	20%乙醇，2~8℃
保质期	5年

注：

① 长期，指介质在很长时间内保持稳定而不对其后续性能产生不利影响的 pH 范围。短期，指根据经验给出的介质再生、在位清洗和消毒的 pH 范围。

使用说明

1、装柱

1.1 装柱缓冲液准备

纯化水，超声脱气15min。

1.2 层析介质准备

计算所需层析介质的量（压缩系数约为1.15），并称取备用。用真空抽滤瓶置换至装柱缓冲液中。置换的介质加入一定量装柱缓冲液，制成约 50-70%浓度的胶悬液。

1.3 层析柱准备

层析柱准备检查层析柱，确保各部件完整、干净。安装下柱头，拧紧O型圈后，将层析柱垂直固定在铁架台上，用水平仪检查并调整使层析柱保持竖直。用注射器吸取装柱缓冲液，接于柱底的出口处，缓慢推出注射器内液体，排除底部筛网的气泡，取下注射器后拧上堵头。层析柱中加入约2cm 高的装柱缓冲液。

1.4 装柱（以直径 16mm，床高 10cm 的层析柱为例）

混匀胶悬液，用玻璃棒引流缓慢倒入层析柱中，若液面离柱顶还有空隙，加装柱缓冲液充满。将调节器连接至层析系统，启动泵以一定流速排除管路及顶部筛网中的气泡后暂停。将调节器沿 45°放入柱中，固定好调节器并拧紧密封圈，注意避免气泡进入。

拧开层析柱底部的堵头，将底部管路放入到废液缸中，流速设为60cm/h，至介质界面无变化后，设置流速为600cm/h，并逐步降低流速到 300 cm/h ，维持该流速 45min，用记号笔在界面处做好标记，暂停系统。拧上底部堵头，层析柱上端与泵断开，稍拧松调节器上的密封圈，将柱头压到胶面以下3mm 处，拧紧密封圈。将层析柱顶部和底部管路连接到层析系统上，进行柱效测定。

2、柱效检测

完成装柱后、使用前可通过柱效测定和评价可以确认层析柱装填质量。柱效通常用理论塔板高度（HETP）和非对称因子（As）来评价。柱效测定可以采用丙酮或者NaCl 作为样品进行，按照下表配制样品溶液和流动相。

样品	1.0%丙酮	0.8 M NaCl
样品体积	1.0%柱体积	1.0%柱体积
流动相	纯水	0.4 M NaCl
流速	30 cm/h	30 cm/h
检测器	UV-280 nm	电导

根据UV或者电导率曲线计算理论塔板高度（HETP）、理论塔板数（N）和非对称因子（As），公式如下：

HETP = L / N

N = 5.54 × (VR / Wh )2

As = a / b

其中：L为柱高； VR为保留体积；Wh为半高峰宽；a为在10%峰高处的第一个半峰宽；b为在10%峰高处的第二个半峰宽。

一般来说，HETP的数值应小于填料平均粒径的三倍（即HETP/D50<3，D50为填料的平均粒径），As应在0.8~1.5之间。

3、分离纯化

3.1 柱平衡

将层析柱连接至纯化设备，使用结合缓冲液冲洗柱 5 CV 以上，至层析柱流出液pH、电导同结合缓冲液的 pH、电导一致。平衡结束后将紫外归零。

备注：结合缓冲液推荐含 1.7 M (NH₄)₂SO₄的缓冲液，经过 0.22μm 过滤，缓冲液中盐种类或 (NH₄)₂SO₄具体浓度和 pH 等根据实际情况选择。

3.2 加载样品

经 0.2 / 0.45 μm 过滤后的样品溶液加载在疏水层析柱上，上样流速推荐 75-150 cm/h，上样体积取决于层析介质载量、样本溶液中与介质结合分子的浓度和其他层析条件。备注：蛋白与疏水层析介质的结合受配基种类、配基密度、缓冲液的离子强度、盐析效应和温度等因素影响，在使用疏水层析分离方式时，需要选择合适的层析条件。

3.3 柱冲洗

使用结合缓冲液冲洗 3-5 CV，将该条件下不与介质结合的杂质洗去（至紫外检测值回归基线附近）。或根据前期实验确定的杂质淋洗条件进行柱冲洗。

3.4 洗脱

使用洗脱缓冲液冲洗层析柱，洗脱流速推荐 75-150 cm/h，收集目标洗脱峰。备注：洗脱缓冲液推荐不含((NH₄)₂SO₄的缓冲液，经过 0.22μm 过滤，缓冲液中盐种类或(NH₄)₂SO₄具体浓度和 pH 等根据实际情况选择。

3.5 清洗和保存

使用纯化水冲洗 5 CV，然后用 20% 乙醇冲洗 5 CV，置于 2-8 ℃环境中保存。备注：阴离子盐析效应由强到弱顺序：PO₄³⁻、SO₄²⁻、CH₃COO⁻、Cl⁻、Br⁻、NO₃⁻、ClO₄⁻、I⁻、SCN⁻。阳离子盐析效应由强到弱顺序：NH₄⁺、Rb⁺、K⁺、Na⁺、Cs⁺、Li⁺、Mg²⁺、Ba²⁺。盐析效应越强则疏水相互作用越强。备注：疏水层析通常用于硫酸铵沉淀和离子交换层析之后；疏水层析缓冲液常选用中性磷酸钠或磷酸钾缓冲液，如 20 mM PB, 1.7 M (NH₄)₂SO₄, pH7.0，通常 (NH₄)₂SO₄浓度在 2 M 以下，NaCl 浓度在 3 M 以下；工艺开发阶段宜采用梯度洗脱模式，即逐渐增加洗脱缓冲液的比例，直到盐浓度达到最低，洗脱过程中分步收集，分别鉴定不同洗脱位置样品，梯度洗脱的结果可作为后续优化分离的基础；当目的蛋白同介质结合较强时，可在洗脱液中加入有机溶剂如乙醇、异丙醇、乙二醇等，加入量应低于 30%，亦可加入表面活性剂如 Tween20、Triton X-100 等。

4、在位清洗

在位清洗（Cleaning In Place，CIP）是去除层析介质上强结合的、沉淀的或者变性的物质。杂质残留将会影响层析柱的层析性能。如果聚集严重，将会堵塞层析柱，加大反压并减慢流速。所以定期的在位清洗能够防止污染物在柱床聚集，

有助于保持介质的载量，流速等。在 CIP 时，可以反向冲洗层析柱。

层析柱在使用 3-5 个循环后需要进行清洗，帮助介质恢复良好的性能。对不同类型的杂质和污染物建议清洗条件如下：

4.1 去除蛋白沉淀和其他杂质：用 1 M NaOH 浸泡层析柱 1 h 以上，然后用 5-10 CV 纯化水冲洗层析柱。

4.2 去除紧密结合的疏水蛋白、脂蛋白和脂质等疏水性杂质：用 4-10 CV 的 70% 乙醇或者 30%异丙醇冲洗层析柱（15-20 min），然后用 3-5 CV 纯化水冲洗层析柱。

4.3 去除其他污染物：用 4 CV 的 0.5-1 M NaOH 以 40 cm/h 流速清洗层析柱，然后用 5-10 CV 纯化水冲洗层析柱。备注：使用有机溶剂清洗时，应采用梯度加入方式，避免在使用高浓度有机溶剂时形成气泡。

清洗后如果立即使用，用结合缓冲液冲洗 3-10 CV 即可。

5、消毒灭菌

消毒灭菌是为了将层析柱中的微生物污染降至最低。本品可使用 NaOH 溶液作为消毒剂。NaOH 溶液可有效去除病毒、细菌、酵母及内毒素，运行成本极低。消毒步骤为：

5.1 使用结合缓冲液将层析柱冲洗3-5CV。

5.2 使用 0.5 M -1M NaOH 溶液以 40 cm/h 冲洗层析柱 0.5-1 h。