基因组范围的CRISPR敲除（GeCKO）文库

基因组范围的CRISPR 敲除（GeCKO）文库能够在人或小鼠细胞中快速产生功能缺失的突变体并且筛选所期望的表型。我们将提供Broad研究所张峰实验室的全部GeCKO（8个）CRISPR文库*。 GeCKO文库是gRNA的混合文库，可以在人或小鼠的基因组内敲除任何表达基因及非表达的基因，如miRNA基因。改进后的GeCKO v2.0文库含有非靶向gRNA作为对照，与此同时用来转导的慢病毒载体也同步进行了升级，以便更高效的富集病毒和提升病毒在原代细胞的转染效率。GeCKO文库已经被广泛使用于原代的人或小鼠细胞，干细胞，癌细胞及各种稳定细胞系。 GeCKO文库允许客户在不同的条件下鉴定任何细胞功能必须的基因，筛选哪个基因的缺失使癌细胞具有耐药性。要获取更多GeCKO文库设计、构建信息，请参考张峰实验室发表的文献：Sanjana N.E., Shalem O., Zhang F. Improved vectors and genome-wide libraries for CRISPR screening. Nat Methods. 2014 Aug;11(8):783-4. doi: 10.1038/nmeth.3047.

文库内容

GeCKO文库选择

*周期为工作日；**需求量可以100 µg为单位向上增加；欢迎咨询，发送邮件中请备注说明文库名称及相应的Cat.No.

交付结果

• 文库（转染级）以25 μg为一个单位量。100 μg 及200 μg文库分别是以4 x 25 μg或者8 x 25 μg形式交付。 随文库发货附带技术指导，MSDS及COA 文件。

• Mouse GeCKO Library A (dual vector): 100 μg混合文库 (研究级)

  • 需求量可以100 µg为单位向上增加，可扩大到900 µg（转染级）

  • 提供项目报告，包括小量测试（Step 1）所做Sanger测序的ABI文件及二代测序验证（Step 4）的统计摘要；如您需要，还可提供完整可用的NGS原始数据。

GeCKO v2.0文库载体选择

为了交付在慢病毒载体上对细胞高效的GeCKO文库，使用双载体系统可以获得较大的病毒滴度；在这个双载体系统中，S.pyogenesCas9（lentiCas9-Blast）和sgRNA（lentiGuide-Puro）分别使用了带有不同抗性筛选标记的单个病毒载体。同时，也可以使用all-in-one的lentiCRISPR v2载体，其具有比原来的lentiCRISPR载体高10倍的病毒滴度。

我们可提供如下有效使用的慢病毒载体以用于GeCKO文库筛选：

GeCKO载体汇总

如何使用GeCKO文库

GeCKO文库是CRISPR gRNA的混合文库，可以在人或小鼠的基因组内敲除任何基因及非表达的基因，如miRNA基因。每条gRNA克隆到优化过的慢病毒载体中以实现高效率地转染原代细胞或培养细胞。GeCKO文库应以较低的MOI值转导细胞，以保证每个细胞进入不超过1条gRNA。转染完成后在进行文库筛选之前，应对细胞进行NGS深度测序，以评估gRNA在细胞中的表现。文库筛选后，还需进行第二轮NGS测序并数据分析，以鉴定在筛选过程中缺失或富集的gRNA。通过GeCKO文库筛选找到真正的阳性克隆，您需鉴定哪些基因相对应的gRNA是被富集的。要获取关于GeCKO文库筛选更多流程，请参考Genome Engineering网站。

GeCKO v2.0文库特点

针对人类或小鼠基因组的每个基因，GeCKO文库的设计包含：6条单链gRNA（sgRNA）以及针对每个miRNA的4条sgRNA，及1000条非靶向性的对照sgRNAs。

这些gRNA分布在每个基因超过3-4个组成型表达的外显子上，以此将脱靶效应降至尽可能低。每个文库均包括两个子文库A和B.每个子文库都分别包含针对每个基因的3个唯一的sgRNA；仅A文库包含可靶向1,864 个miRNAs中任意一个miRNA的4条sgRNA。A和B子文库都包含了1000个非靶向性的对照sgRNA.使用单个子文库能够覆盖基因组范围，但也减少了完成一次筛选所需要的细胞数量。当实验的细胞数量有限时（例如，原代细胞或体内筛选），这是非常有用的；当然，如需更大的筛选可以通过结合两个子库来完成。